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Análisis de la toxicidad de un producto en el besugo

Métodos y técnicas de estudio en genética
by

María Veiga Gómez

on 13 May 2013

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Transcript of Análisis de la toxicidad de un producto en el besugo

Métodos y técnicas de estudio en genética Análisis de la toxicidad
de un producto
en el besugo El besugo es una de las especies que se está incorporando al cultivo en acuicultura.

La acuicultura moderna representa una gran revolución en la producción de pescado y alimentos de origen acuático.
El fotoperiodo fue de 12:12 horas.

Los peces fueron alimentados una vez al día con una dieta comercial.

El agua de los tanques fue renovada cada 2 días.

Los residuos fueron eliminados diariamente por succión.

Cada grupo se expone a una concentración de 0, 5, 10 y 15 µg/L de la nueva droga.

Para el test de micronúcleos, las muestras de sangre se obtuvieron después de 2, 4 y 6 días, de la vena caudal. Licenciatura en Biología 2012/2013 María Veiga Gómez
Javier Marcote Sánchez La importancia de realizar análisis toxicológicos de las sustancias que se añaden a la dieta de los peces en acuicultura, radica en la inocuidad de los mismos para los humanos.

La nueva droga usada, reduce la cantidad de grasa acumulada.



Es importante reducir esta cantidad, ya que si es muy elevada, produce cambios en el sabor, o en la textura del producto cocinado en la boca.
1. Ayers, K. M., Clive, D., Tucker, W. E., Hajian, G., De Miranda, P. 1996. Nonclinical Toxicology Studies with Zidovudine: Genetic Toxicity Test and Carcinogenicity Bioassays in Mice and Rats. Rev. Fundamental and Applies Toxicology 32, 148-158.

2. Collins, A. R. 2004. The Comet Assay for DNA Damage and Repair. Rev. Molecular Biotechnology Volumen 26.

3. Laining, A., Ishikawa, M., Koshio, S., Lideman & Yokoyama, S. 2012. Dietary inorganic phosphorus or microbial phytase supllementation improves growth, nutrient utilization and phosphorus minerlization of juvenile red sea bream. Rev. Aquaculuture Nutrition 18, 502-511.

4. Peso-Echarri, P., Frontela-Saseta, C., Santaella-Pascual, M., García-Alcázar, A., Abdel, I., Ros-Berruezo, G., Martínez-Graciá, C. 2012. Sodium alginate as geed additive in cultured sea bream.Rev. Food Chemistry 135, 699-755.

5. Trossero, C., Caffarena, G., Hure, E. & Rizzotto, M. 2006. Det ección de mutagenicidad en compuestos N-nitroso con el Test de Ames. Rev. Acta Farm. Bonaerense 25, 139-44.

6. Woodruff, R. S., Li, Y., Yan, J., Bishop, M., Jones, M. Y, Watanabe, F., Biris, A. S., Rice, P., Zhou, T. & Chen, T. 2012. Genotoxicity evaluation of titanium dioxide nanoparticles using the Ames test and Comet assay. Rev. Journal of Applied Toxicology 32, 934-943.

7. Zalacain, M., Sierrasesúmaga, L., Patiño, A., 2005. El ensayo de micronúcleos como medida de inestabilidad genética inducida por agentes genotóxicos. Rev. An. Sist. Sanit. Navar. 28, 227-236. 5. Bibliografía Índice 1. Introducción 2. Material y Métodos 3. Resultados 4. Discusión 5. Bibliografía Cepas de S. typhimurium genéticamente modificadas (requieren histidina para su crecimiento) en presencia y ausencia de la nueva droga a ensayar, en un medio sin histidina.

Concentraciones: 0, 3, 10 y 20 µg/placa.

Incubadas durante 48 horas a 37ºC.

Después de la incubación, se cuentan las colonias formadas (Quebec® Darkfield Colony Counter (Reichert Technologies, Depew, NY, USA)). Los frotis de sangre:

Secados al aire después de la fijación con etanol puro durante 20 minutos.
Teñidos con Giemsa 10% durante 25 minutos.
Se preparan dos frotis para cada muestra de cada pez, contando 500 células viables.
Es necesario diferenciar células en vías de apoptosis y necrosis, ya que solo se deben incluir células viables.

Micronúcleos Cuerpos cromatínicos pequeños, no refractivos, circulares u ovoides, que muestran el mismo grado de tinción que el núcleo
La electroforesis se realizó usando la misma solución a 25 V, 300 mA (25 minutos).

Las placas fueron neutralizadas con buffer 0.4 M Tris a pH=7.5 y teñidos con 75 µl de bromuro de etidio.

Fueron examinadas usando un microscopio de fluorescencia.

Se contaron 200 células (100 en cada réplica). Después de evaluar la normalidad de los datos, se usaron test paramétricos y no paramétricos, para detectar diferencias con un nivel de significación de 0.05.

Las diferencias entre los valores se compararon mediante el test de Student.

La distribución de los datos del Comet assay es generalmente no Gaussiana, incluso después de la transformación logarítmica, lo que impide el uso de test paramétricos.

Así aplicamos el test de la U de Mann-Whitney en la evaluación de los datos del Comet Assay. Se compararán las colonias del control negativo con las placas a las que se añadió la droga, en diferentes concentraciones.

Una sustancia, natural o sintética se considera mutagénica cuando el coeficiente de reversión, C.R., es mayor que 2
(C.R.= número de colonias revertantes por placa ensayada/número de colonias revertantes por placa control). Las condiciones óptimas de un ensayo de MN requieren un porcentaje de células binucleadas entre 35-60% sobre 500 células viables. Los daños en el DNA fueron cuantificados visualmente y el parámetro utilizado para medir el daño, es la longitud de la cola y la intensidad relativa de la fluorescencia de la cabeza y la cola (normalmente expresado como un porcentaje de ADN en la cola).

La extensión de ADN liberado de la cabeza es directamente proporcional a la cantidad de daño en el ADN.

Se calcula como la suma de las células con daño tipo 2, tipo 3 y tipo 4. Las placas donde se añadió la droga se comparan con las placas control, y el resultado será óptimo cuando no haya diferencias significativas entre ambas. Tras analizar los resultados de las pruebas realizadas, podemos decir si la nueva droga utilizada en la dieta de los besugos produce efectos negativos en los animales.

En primer lugar se realiza el test de Ames con bacterias, ya que si este test, nos da un resultado negativo, es decir, resulta que la nueva droga es mutagénica, no tiene sentido realizar más pruebas.

Por otro lado, si no es mutagénica, podemos realizar otro tipo de test, como en este caso, el test de Micronúcleos o el Comet Assay.
Se basa en procesos biológicos para gestionar

Bienestar de los animales,
Los aportes de nutrientes,
La producción de residuos
El medio ambiente en el que viven. Algunas de las dietas actuales hacen acumular más grasa en los animales de la deseada. Una empresa ha desarrollado una nueva droga que disminuye esta proporción de grasa y a nosotros nos corresponde realizar el análisis toxicológico para determinar la inocuidad de la misma El reglamento sobre la producción acuícola establece directrices sobre:

El origen de los animales
Prácticas de manejo
Reproducción y alimentación
Prevención de enfermedades
Tratamiento veterinario. La acuicultura ecológica. Algunas de las dietas actuales hacen acumular más grasa en los animales de la deseada.

Una empresa ha desarrollado una nueva droga que disminuye esta proporción de grasa y a nosotros nos corresponde realizar el análisis toxicológico para determinar la inocuidad de la misma. "revolución azul"
Test de Ames


Ensayo de Micronúcleos


Comet Assay


Análisis estadístico Individuos juveniles de besugo de 4±1 cm de longitud se aclimataron bajo condiciones de laboratorio durante 3 semanas. Realizado de acuerdo al método de Tice et al. (2000) con algunas modificaciones.

Las muestras de sangre fueron tomadas de los mismos peces, y fueron diluidas con 1 ml de PBS.

Sobre 60 µl de la muestra diluida fueron mezclados con 200 µl de Agarosa LMP al 0.65%. 75 µl

Placas precubiertas con Agarosa NMP al 0.5%,

Cubreobjetos

Refrigerador

Durante 10 minutos (solidificar)

Tercera capa de Agarosa LMP

Placas sumergidas en una solución fría de lisis (2.5 M NaCl, 100 mM Na2-EDTA, 10 mM Tris, pH=10, con 10% de DMSO y 1% de Triton X-100)

Refrigeradas a 4ºC (2 horas). Después de la lisis, las placas se colocaron en una caja horizontal de electroforesis (llenado con solución de electroforesis (1 mM Na EDTA, 300 mM NaOH y pH=13,5) hasta un nivel aproximadamente de 0.25 cm sobre las placas durante 20 minutos). Que son Células con 2 núcleos fueron consideradas binucleadas.
Los núcleos globulares tenían pequeñas evaginaciones en la membrana nuclear y contenían eucromatina.
Los núcleos con evaginaciones mayores que los anteriores, fueron considerados núcleos lobulados.
Núcleos con vacuolas o vacíos fueron anotados como núcleos mellados. Las anormalidades nucleares fueron clasificadas en 4 grupos. Densidad de 15 individuos en 4 acuarios de 40 litros (temperatura=23ºC; dureza de calcio=54 mg/l; dureza total; 70 mg/l CaCO3; pH=7.82; O2 disuelto=6.1 mg/l; conductividad=0.209 mS/cm; amonio=0.001 mg/l).
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