Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

RESKTİRKSİYON ENZİMLERİ SINIFLANDILMASI ÇEŞİTLERİ VE KESME M

No description
by

Neslihan Sevgi

on 28 October 2014

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of RESKTİRKSİYON ENZİMLERİ SINIFLANDILMASI ÇEŞİTLERİ VE KESME M

1970’de Smith ve arkadaşları HindII’yi saflaştırıp, kesim ve tanıma bölgelerini karakterize etmişlerdir. Bu yıldan sonra pek çok RE saf olarak elde edilmiştir

Daha sonraki yıllarda, Arber ve Dussoix konak-kontrol restriksiyon modifikasyonunu açıklayabilmek için moleküler bir metot oluşturmuştur. Bu metotla, bazı bakteriyel suşların DNA’yı kesebilen endonükleazlara ve bu arada kendi DNA’larını koruyabilmek için ise suş-spesifik modifikasyon sistemine sahip oldukları ortaya konmuştur.

RE’ lerin isimlendirmesinde önce enzimin elde edildiği bakteri cinsinin ilk harfi, daha sonra bakteri türünün ilk iki harfi ve son olarak da soya ait bir harf ile ilk izolasyondan başlayarak Romen rakamı ile enzimin izolasyon sırası belirtilir.
Restriksiyon endonukleazlar çift iplikcikli DNA da yaptıkları kesimlerin özelliklerine göre başlıca 3 gruba ayrılmaktadırlar
Örneğin

EcoRI enzimi için;

E = cins (Escherichia)
co = tür (coli)
R = suş (RY 13)
I = Bu mikroorganizmadan izole edilen ilk RE olduğunu belirtir.

TİP II :
Bu gruptaki enzimler, çift iplikcikli DNA' da spesifik yerlere bağlanırlar ve belli bir uzunlukta (4-7 baz çifti kadar) iki iplikçik te kesmeler yaparlar.
Bu enzimler rekombinant DNA teknolojisinde veya diğer genetik manipulasyonlarla güvenle kullanılabilirler.
Bakterilerden çok sayıda Tip 2 enzim elde edilmiş ve pürifiye edildikten sonra biyoteknolojik çalışmalarda kullanılmak için ticarete sunulmuştur
Ayrıca, bu enzimler hem endonuklease ve hem de metilasyon yapma aktivitesine sahiptirler. Böylece DNA'daki kesim yerlerini modifiye ederek genomu korurlar. Bu gruptaki enzimler, genetik manipulasyonlarda güvenle kullanılamazlar. Örn, EcoAI, EcoBI, EcoDI, EcoK, vs. gibi.
İSİMLENDİRME
RESKTİRKSİYON ENZİMLERİ SINIFLANDILMASI ÇEŞİTLERİ VE KESME MEKANİZMASI

Luria ve arkadaşları konak tarafından kontrol edilen restriksiyon modifikasyon olarak isimlendirdikleri bir olguyu 1950’li yılların başında bildirmişlerdir. Yaptıkları çalışmalarda bir bakteriyel suşta (Escherichiacoli K) iyi üreyen bakteriyofajın aynı bakterinin farklı suşunda (E. coli C)zayıf bir şekilde ürediğini belirlemişlerdir.
SINIFLANDIRILMASI
Tip I:
Bu grupta bulunan restriksiyon enzimleri büyük bir kimyasal kompleksiteye sahiptirler.
Bunlar, DNA üzerinde spesifik sekansları tanırlar fakat başka yerlerden ve değişik uzunluktan keserler.

Tip III:
Bu enzimler de etkinlik bakımından Tip I'e benzerler. Bu nedenle de kullanım alanları çok az veya yoktur. birbirine dönük olan iki ayrı, palindromik olmayan dizi tanırlar. DNA'yı tanıma yerinden 20-30 baz uzakta keserler.Örneğin EcoR15
PEKİ RESTRİKSİYON ENZİMİ
NEDİR ?
Restriksiyon enzimi veya restriksiyon endonükleazı çift zincirli DNA moleküllerindeki belli nükleotit dizilerini tanıyan ve her iki zinciri birlikte kesen bir enzim türüdür. Bu özel enzimler, bakteri ve arkelerde bulunurlar ve virüslere karşı bir savunma mekanizmasına aittirler.
Bu gruptaki enzimler DNA daki aktivitelerine göre başlıca 4 kategoriye ayrılmaktadırlar.

1)Yapışkan uç oluşturanlar
2) Küt uç oluşturanlar
3) İzoşizomerler (isoschizomer)
4) Değişik tanıma yapanlar

Restriksiyon enzimleri ;
iki fonksiyonel alt birimden meydana gelmiştir.
• DNA tanıma bölgesi
• Katalitik alan

DNA TANIMA BÖLGESİ
Yaklaşık 390 monomerden meydana gelen N terminal
bölgesinden meydana gelmiştir .
N terminal bölgesi D1, D2, D3 alt bölgelerinden oluşur.
Spesifik tanıma Bölge sini tanıyıp
katalitik alanı buraya yerleştirirler.
KATALİTİK ALAN
DNA tanıma bölgesine yerleştirilen katalitik bölge heliksin
fosfodiester bağlarını kırar.

1) Yapışkan uç oluşturanlar:

DNA üzerinde kesim yaptıklarında yapışkan uçlar (komplementer uçlar) oluşturan enzimler, 4-7 bazlık bir mesafeden asimetrik olarak soldan sağa veya sağdan sola doğru kesim etkinliği gösterirler.

Klonlamada en çok kullanılan enzimlerin birinin (Örn., EcoRI) kesim tarzı aşağıda kısaca belirtilmiştir. EcoRI, çift iplikcikli DNA da 6 baz aralıkla kesme yapar. Kesim yönü 5' 3' olur.
Bölünen DNA segmentinin iki ucunda, birbirleriyle veya aynı uçlara sahip yabancı gen DNA segmentinin uçlarıyla birleşmeye hazır iki yapışkan uç meydana gelir.
2) Küt uç oluşturanlar :

Bazı enzimler de çift iplikcikli DNA'da kesimler yaparak küt uçlar oluştururlar. Bu tür enzimlerden, Örn., Bal I, çift iplikcikli DNA'daki kesim tarzı şöyledir.
3) İzoşizomerler (isoschizomer): Gerek yapışkan uç ve gerekse küt uç oluşturan RE'lerden bazıları DNA üzerinde aynı yeri tanırlar ve oradan kesim yapabilirler.
Örn.
Bam HI 5'... G/GATCC ... 3' yapışkan uçlar
Bst I 5'... G/GATCC ...3' (5'-ucundan kesim)
Pal I 5'... GG/CC ....... 3' küt uçlar

4) Değişik tanıma yapanlar:
Az da olsa bazı RE'lerin birden fazla tanıma ve kesme bölgeleri bulunabilmektedir. Örn.,
Hind II 5'... GTCAAC ...3'
5'... GTCGAC ...3'
5'... GTTAAC ... 3'
5'... GTTGAC ...3'

Restiksiyon Endonükleazlar

DNA moleküllerindeki belli nükleotit dizilerini tanıyan ve her iki zinciri birlikte kesen bir enzim türüdür.
Restriksiyon Enzimleri
RESTRİKSİYON ENDONÜKLEAZLAR NERELERDE KULLANILIR?
• DNA haritası çıkartılmasında
• Popülasyon polimorfizminin analizinde
• DNA molekülünün yeniden düzenlenmesinde
• Probların hazırlanmasında
• Mutant organizmaların meydana getirilmesinde
• DNA’nın modifikasyon statülerinin analizinde

Restriksiyon Haritalama
Kaynakçalar :
1)Genetik Kavramlar William S.Klug syf:
458-460
2)Campbell Biyoloji syf:377
3)http://www.cilginbiyologlar.com/forum/viewthread.php?thread_id=8502
4)http://eskisite.mikrobiyoloji.org/dokgoster.asp?dosya=110015400
5)http://yunus.hacettepe.edu.tr/~coner/GEN/01/rest.htm
6)Restriksiyon Enzimleri by Suzan ACAR on Prezi.com
7)http://www.deu.edu.tr/UploadedFiles/Birimler/16928/gen_muh_ders-3.pdf
8)http://anibal.gyte.edu.tr/hebe/AblDrive/71167157/w/Storage/217_2011_1_113_71167157/Downloads/restriksiyon-endonkleazlar.pdf

CEM BAŞKAYA
114310012
NESLİHAN SEVGİ
104310035
TARİHÇE
Saflaştırılmış restriksiyon enzimleri çeşitli bilimsel uygulamalardaki DNA manipülasyonlarında kullanılır.
Restriksiyon enzimleri gen klonlaması ve protein ifadesi deneylerinde, Plazmit vektörlerlerin içine genler sokmak için kullanilirlar. Gen klonlama deneylerinde kullanılan plazmitlerde genelde kısa bir "çoklu bağlayıcı" dizi (İng. polylinker; çoklu klonlama yeri) bulunur. Gen parçalarını plazmit vektörün içine sokarken bu diziler kolaylık sağlar; genin içinde doğal olarak bulunan restriksiyon yerleri DNA'yı kesmek için kullanılacak endonükleaz seçimini etkiler, çünkü arzu edilen DNA'ya zarar vermeden onun uçlarının kesilmesi gerekmektedir. Bir gen parçasının bir vektörün içine klonlamak için hem plazmit DNA'sı hem de gen parçası aynı restriksiyon enzimi ile kesilir, sonra bunlar DNA ligaz olarak adlandırılan bir enzimle birbirlerine yapıştırılır.
UYGULAMALAR
Benzer şekilde, restriksiyon enzimleri Southern blot yöntemiyle genomik DNA'nın kesilmesinde kullanılır. Bu yöntem ile, bir kişinin genomunda bir genin kaç kopyası olduğu belirlenebilir. Bu yöntemin bir diğer uygulamasında belli bir toplulukta kaç tane gen mutasyonu (polimofizmi) olduğu belirlenebilir, buna restriksiyon parçası uzunluk polimorfizmi (İng. restriction fragment length polymorphism, RFLP) denir.
İlk olarak, 1968’de, Arber ve Linn EcoB RE’ın nükleaz aktivitesini göstermişlerdir. Aynı yıl Meselson ve Yuan E.coli K’da benzer bir enzimi elde etmişlerdir. Daha sonraki yıllarda, bu enzimlerinTip I RE’lar oldukları belirlenmiştir
EKZONÜKLEAZ Genellikle ribonükleotit veya deoksiribonükleotit zincirlerinin son kısmındaki fosfodiester bağlarının hidrolizini katalize eden ve mononükleotitleri meydana getiren herhangi bir nükleaz.
Bunlar kesme yönlerine göre 2 tip mevcuttur.
5’→3’ eksonükleaz olanlar ve 3’→5’ eksonükleaz olanlar

ENDONUKLEAZLAR
Çift zincirli DNA da özel dizileri tanıyan ve her iki ipliğinde
kesme yapan enzimlerdir.
Bu enzimlerin görevi: yabancı DNA ları kesip atmaktır.
Restriksiyon endonükleazlar (RE) prokaryotlarda bulunan,
ökaryotlarda bulunmayan çift zincirli (ds) DNA’daki iç (internal)
fosfat bağlarını rasgele kıran endonükleazlardan
(DNaz, fosfodiesteraz) farklı olarak 4, 6, ve 8 nükleotidden
oluşangenomda iki yönlü simetri oluşturan polindromik
bölgelerdeki (tersten ve düzden okunuşu karşılıklı her iki
iplikte de aynı olan) baz dizilerini tanıyıp, kesen endonükleazlardır.


NÜKLEAZLAR

Nükleazlar bir DNA zincirinde
bir nükleotidin sonraki ile bağlantısını,
fosfodiester bağlarını kırarak yıkar.
İki farklı tip nükleaz çeşidi vardır:
Özellikle, EcoRV,
PvuII, EcoRI, BamHI ve son zamanlarda
daha sık kullanılan Cfr101 ve BgII gibi
enzimler hidrolitik enzimlerin yapısının ve fonksiyonunun anlaşılmasında faydalı bilgiler
sağlamıştır.
HOMING ENDONÜKLEAZLAR

Protein yapıları bakımından diğer RE’lardan
farklılık gösteren, uzun ve asimetrik bölgeleri tanıyıp kesen, aktivitesi için protein ve RNA’ya ihtiyaç duyan enzim grubudur. Daha az tanıma özgüllüğü göstermekte ve tanıma bölgelerindeki tek baz değişimlerini tolere edebilmektedirler.

NICKING ENDONÜKLEAZLAR

RE’larçift zincir DNA’ya bağlanıp kesim yaparlar.
Tek zincire bağlanıp endonükleaz aktivitesi gösteren enzim grubuna da “nicking”endonükleazlardenilmektedir.

Restriksiyon endonükleaz (RE) enzimleri, kısa DNA dizilimlerini özgül olarak tanıyan
ve bu dizilimlere yakın bölgelerden veya bu dizilimler içindeki spesifik bölgelerden DNA’yı
kesen enzimlerdir. Bu dizilere
palindromik

diziler
adı verilir.
Teorik olarak DNA’da iki çeşit palindromik dizi olabilir.
İlki yansımalı palindrom normal metinlerdeki gibi olur,aynı DNA dizisi üzerindeki dizinin normalde tersten oknuşu aynı olur (örneğin GTAATG gibi).

İkincisi evirtik tekrarlı palindrom da iki yönden aynı okunur ama ileri geri diziler komplemanter dizilerinde yer alır.Örneğin GTATAC dizisinde olduğu gibi,bu dizinin komplemanter dizisi tersten okununca CATATG elde edilir.Evirtik tekrarlar restriksiyon enzimlerinde daha yaygındır ve yansımalı palindromik dizilerden daha önemli biyolojik role sahiptir.


STAR AKTİVİTE

Restriksiyon endonükleazların özellikleri üzerine yapılan çalışmalar, bunların çok ilginç özelliklere sahip olduklarını ortaya koymuştur. Özelliklerin en dikkate değer olanı, bu enzimlerin optimal şartlarda özgül DNA’yı en yakın dizilimden ayırt edebilme başarılarının, optimal olmayan şartlarda oldukça değişmesidir.. Örneğin, EcoRI enziminin tanıma bölgesi (5’-GAATTC-3’)’ne bağlanma oranı en yakın tanıma bölgesi (5’-TAATTC)’ne kıyasla 105 kat daha fazladır. Ancak, enzim için optimal olmayan şartlar altında oran oldukça değişmekte ve pek çok enzim için bu durum söz konusu olmaktadır. Benzer bölgeleri kesme işlemine, bir enzimin star aktivitesi denilmektedir.
Restriksiyon Enzimi Tepkime Şartları
pH:
Pek çok RE pH 7.2 -8.5 arasında aktiftir.
Mn+2 :
Ticari olarak mevcut RE’ler kofaktör olarak yalnızca Mg+2’ye ihtiyaç duymaktadır. Reaksiyon şartlarında özellikle Mn+2 varlığı enzimin star aktivitesini ortaya çıkarmaktadır.
Tuz konsantrasyonu:
RE’lerin pek çoğu 50-150 mM NaCl ya da KCl ortamında kesim yaparken bazı enzimler için 20 mM’dan fazla tuz konsantrasyonu enzimin etkinliğini ortadan kaldırmaktadır.
Bovin serum albumin (BSA):
Enzimin stabilitesini sağlamak amacıyla saklama ve çalışma tamponu içerisinde BSA bulundurulmaktadır. BSA ile enzim; proteaz, spesifik olmayan adsorbsiyon ve ısı gibi çevresel zararlardan korunmaktadır.
Gliserol:
RE’ler – 20°C’de saklanırken saklama tamponu içerisine gliserol katılmaktadır. Bu tedbir enzimin donmasını engellemektedir. Böylece enzimin dondurulup çözdürülmesi esnasında göreceği zarar azaltılmaktadır. Pek çok enzim için son konsantrasyonda %5’ten fazla gliserol, enzimin star aktivitesine sebep olmaktadır. Ancak, bazı enzimlerin %10 gibi yüksek gliserol konsantrasyonunda da normal kesim yaptıkları ortaya konmuştur.
İnkübasyon ısısı:
Pek çok RE maksimum aktivitesini 37°C’de göstermektedir. Genel olarak bu enzimlerin inkübasyon ısıları orijin aldıkları bakterinin üreme özelliklerini yansıtmaktadır. Bu nedenle enzimlerin farklı ısı ihtiyaçları bulunmaktadır.
DNA konsantrasyonu:
Substrat olarak kullanılan DNA’nın miktarı RE kesimini etkilemektedir. Az bir hacim içinde çok miktarda DNA bulunması, enzimin difuzyonunu engellemekte ve etkinliğini büyük ölçüde düşürmektedir. Oldukça düşük DNA konsantrasyonları da enzim tarafından kesimin verimini etkilemektedir.

RE’ların
DNA’ya BAĞLANMA ve KESME
MEKANİZMALARI

Restriksiyon endonükleazlar yalnızca bazlar arasında yatay konumda bulunan fosfodiester bağlarını kırarlar. Karşılıklı iki baz arasındaki Hidrojen bağlarının kesiminden sorumlu değildirler. Hidrojen bağları zayıf olduğu için fosfodiester bağlarını kırılmasıyla ve çözeltideki termal hareketten doğan enerjinin etkisiyle kendiliğinden kırılırlar.
Restriksiyon endonükleazın tanıma dizisinde meydana gelebilecek herhangi bir mutasyonal bir değişim,verilen baz çifti bölgesinin kesilmesini önler. Örneğin GAATTC Eco R I tarafından kesilir. Ama GTATTC kesilmez
DNA ligaz adındaki enzimler kırılan fosfodiester bağlarını tekrar bağlayabilirler. Böylece restriksiyon endonükleazlar tarafından kesilen fragmentler tekrar bağlanabilirler. Bu rekombinant DNA teknolojisinin temelidir.
Full transcript