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Obtenção da beta-galactosidase a partir do Aspergillus oryzae

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Obtenção da Beta-Galactosidase a partir do
Aspergillus oryzaeβ

Enzimas
Taiane Regina Guerini Pereira
Biotecnologista graduada pela Universidade Federal da Grande Dourados (UFGD)
Cursando MBA em Gestão Indutrial e Manufatura Enxuta

BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA NO MUNDO
As grandes empresas farmacêuticas e empresas de biotecnologia estão localizadas em sua maioria nos países desenvolvidos, como
Estados Unidos, países Europeus e Japão.
Os
Estados Unidos
são o principal produtor de medicamentos no mundo, correspondendo por aproximadamente 39,3% da produção global, seguidos por Japão e Alemanha. Em conjunto, EUA, Japão e Alemanha detêm 84% de toda produção mundial. Em 2007, as 386 empresas de biotecnologia concentradas nos EUA foram responsáveis por um faturamento de cerca de 65 bilhões de doláres (REIS et al.2009).
Considerando o mercado global de medicamentos, um estudo da Evaluate Pharma de 2010 demonstra a participação crescente dos medicamentos biotecnológicos desde 2002, fazendo uma projeção do que se espera até 2016, segundo o gráfico 1 (LAGE, 2011).
BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA NO BRASIL
Drogas biotecnológicas estão se tornando o foco de investimento das indústrias inovadoras, mercado considerado menos exposto à concorrência, cuja produção é, em tese, mais difícil de copiar.
Apesar de sua modesta participação de 3% na produção mundial de medicamentos, o Brasil tem relevância crescente tanto para a indústria convencional quanto para a biofarmacêutica, por ser o 6º maior mercado consumidor. E os produtos de origem biotecnológica já respondem pela maior parcela das despesas do Sistema Único de Saúde (SUS) com medicamentos (Revista FACTO, 2014).
A busca de competência nas novas plataformas da biotecnologia em saúde humana é considerada estratégica pelo governo federal.
A incorporação da rota biotecnológica por parte da indústria farmacêutica nacional apresenta também um elevado impacto econômico em função do potencial de mercado e do alto valor agregado associado à produção biofarmacêutica.

Os gastos do SUS com medicamentos biológicos são significativos e têm aumentado nos últimos anos. Segundo levantamento do Ministério da Saúde, do total de gastos do SUS com medicamentos de alto custo no ano de 2008, 41% foram gastos com medicamentos biológicos e 59% com medicamentos de base química, como pode ser visto no gráfico 3.
Já o gráfico 4 evidencia que, em termo de volume, os biológicos respondem por apenas 2% contra 98% dos medicamentos de base química, reintegrando o altíssimo valor agregado que os medicamentos de base biológica representam (REIS et al, 2010).
As enzimas são utilizadas pelo homem para catalisar inúmeras reações há muito tempo, pois se sabe que a produção de vinho, pão e queijo, por exemplo, antecede os tempos bíblicos, embora naquela época não se conhecesse tão profundamente o mecanismo das reações envolvidas no processo de produção desses produtos (HARGER et al., 1982; SPIER, 2005).
À medida que o conhecimento da natureza das enzimas foi se desenvolvendo, extratos obtidos a partir de tecidos animais ou vegetais, e também produzidos por várias espécies de bactérias, fungos e leveduras, as aplicações técnicas para as enzimas foram se aprimorando (LEADLAY, 1993; SPIER, 2005).
Industrialmente uma das principais fontes produtoras de enzimas são os micro-organismos. Estes são considerados fontes atrativas pois:
- Apresenta baixo custo de produção.
- Podem ser cultivados em grandes quantidades.
- Tempo relativamente curto de produção.
- Não está condicionada às questões sazonais e geográficas
- Possibilidade de uso de matérias-primas pouco dispendiosas.


PRINCIPAIS ENZIMAS MICROBIANAS
DE INTERESSE FARMACÊUTICO

Lipase - Auxiliar digestivo
Amilase - Auxiliar digestivo
Celulase - Auxiliar digestivo
Lactase - Intolerância a Lactose
Invertase - Redução do colesterol
Proteases – Quimioterápicos

Beta-Galactosidase ou Lactase
A lactose pode ser hidrolisada pela beta-galactosidase, a qual a transforma em glicose e galactose (CUNHA et al. 2008).
Quando utilizada na indústria alimentícia a βbeta-galactosidase garante alimentos com baixo teor de lactose melhorando a solubilidade e digestibilidade do leite e derivados (SANTIAGO, 2004).
As galactosidases podem originar-se de diferentes fontes tais como: pêssego, amêndoa, rosas selvagens;
organismos animais
como intestino, cérebro e tecido da pele;
leveduras
como
Kluyveromyces lactis
,
K. fragillis
e
Candida pseudotropicalis
;
bactérias
como
Escherichia coli
,
Lactobacillus bulgaricus
,
Bacillus sp
e
Streptococcus lactis
e
fungos
como
Aspergillus foetidus
,
A. niger
,
A. oryzae
e
A. phoenecis
(LONGO, 2006). Entretanto, quando tais fontes da enzima são comparadas, as fontes microbiológicas são as mais importantes para a área tecnológica (MAHONEY, 1998).
A enzima βbeta-galactosidase é produzida intracelularmente por bactérias e leveduras, sendo necessária autólise das células utilizando solventes orgânicos para a liberação da enzima para o meio reacional, e excretada por fungos, facilitando sua separação do meio (OLIVEIRA, 2008). Para o uso em alimentos nem todas as fontes de βbeta-galactosidase são aceitáveis. Enzimas extraídas de
A. níger
,
A. oryzae
e
Saccharomyces sp
(
lactis
ou
fragillis
) são consideradas seguras devido aos numerosos estudos realizados e seu histórico de aplicação (CARMINATTI, 2001).
Aproximadamente 75% da população mundial adulta possuem alguma deficiência de beta- galactosidase na mucosa do intestino delgado, resultando em diferentes níveis de intolerância à lactose. A má absorção de lactose no intestino delgado resulta em desconforto abdominal (Swagerty et al., 2002), má absorção de cálcio e aumenta o risco de doenças nos ossos (Laaksonen et al., 2009).
RDC Nº 26, DE 26 DE MAIO DE 2009

Art. 1º Aprovar a lista de enzimas permitidas para uso em alimentos destinados ao consumo humano conforme a sua origem, constante do Anexo desta Resolução, em substituição ao Anexo I da Resolução RDC Nº 205 de 14 de novembro de 2006.
Para a produção de lactase são aprovados os seguintes micro-organismos:
Aspergillus niger
,
Aspergillus oryzae
,
Candida pseudotropicalis, Kluyveromyces fragilis,

Kluyveromyces lactis
,
Kluyveromyces marxianus
e
Saccharomyces sp.

Micro-organismos viáveis para a produção de Beta-Galactosidase
Propriedades da Beta-Galactosidase obtidas a partir de diferentes micro-organismos
Prenosil et al (1985), utilizaram beta-galactosidades extraídas de fungos (
A. níger
e
A. oryzae
) e de leveduras (K. fragilis e
K. lactis
), para comparar a produção de oligossacarídeos para a hidrólise enzimática da lactose. Os resultados obtidos demonstraram que a lactase obtida de A. oryzae é a que produz maior quantidade de polissacarídeos, especificamente trissacarídeos e tetrassacarídeos.
Aspergillus oryzae
Esta espécie é utilizada há um milênio na produção das tradicionais comidas
fermentadas da culinária japonesa (Machida et al., 2005) e é descrita na literatura
como sendo capaz de produzir e secretar uma grande variedade de enzimas em
diferentes formas de cultivo (Iwashita, 2002; Kitano et al., 2002).
Fontes comerciais de Beta-Galactosidase
Fontes comerciais de lactase no Brasil
LACTANON
Produzido pela: EMS Genéricos
Comercializado pela: Nova Química
LACTOSIL
Aspen Farmacêutica
DIGELAC
Laboratório Catarinense S.A.
LACTO-PRÓ
Produzido pela: FQM Farmoquímica
Comercializado pela: Invictus Farmanutrição
Apresentação:
3o tabletes dispersíveis

FCC/g (atividade enzimática):
10.000

Micro-organismo:
Aspergillus oryzae

Valor aproximado:
56,00 reais


Apresentação:
3o sachês

FCC/g (atividade enzimática):
10.000

Micro-organismo:
Aspergillus oryzae

Valor aproximado:
69,00 reais


Apresentação:
3o sachês

FCC/g (atividade enzimática):
10.000

Micro-organismo:
Não informado

Valor aproximado:
77,00 reais


Apresentação:
3o sachês

FCC/g (atividade enzimática):
10.000

Micro-organismo:

Lactobacillus sp.

Valor aproximado:
32,00 reais


O
Aspergillus oryzae
é notadamente conhecido na literatura por se desenvolver em culturas em estado sólido, em especial relacionadas à culinária japonesa. Além disso, a espécie é descrita como sendo capaz de produzir e secretar grande número de proteínas, em especial enzimas, fato também apontado pela análise do genoma do microrganismo.

É descrito que
A. oryzae
secreta um número maior de proteínas quando crescido em estado sólido quando comparado ao crescimento em estado líquido (Machida et al, 2008; Oda et al, 2006).
FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO
A fermentação no estado sólido apresenta como vantagens o baixo custo e simplicidade das matérias-primas empregadas como meio de cultivo durante a fermentação, menor probabilidade de contaminação, devido a menor quantidade de água presente no meio e a possibilidade de obtenção da enzima extracelular mais concentrada (PANDEY, 2003). Outra questão interessante é a alta produtividade obtida com esta técnica (COUTO e SANROMÁN, 2006).
O meio de cultura utilizado em uma fermentação deve atender à demanda nutricional do micro-organismo produtor, aos objetivos do processo e à escala de operação, e pode representar até 70% dos custos gerados.

No Brasil, país com abundância em agroindústrias, a utilização de resíduos como substrato para a produção de bioprodutos, como enzimas, contribuem para a redução dos custos dos bioprocessos e para a despoluição ambiental, além de agregar valor a esses materiais. Neste contexto, a fermentação no estado sólido (FES) é uma alternativa interessante para a produção de enzimas.
MATERIAIS E MÉTODOS
Cepas de Aspergillus Oryzae a serem utilizadas
É possível comprar diferentes linhagens fúngicas, como diferentes cepas de
A. oryzae
, em coleções de culturas nacionais, dentre elas:
* CBMAI - Coleção brasileira de microrganismos do meio ambiente e indústria. (Campinas - SP)
* CCIBt - Coleção de Culturas de Algas, Cianobactérias e Fungos do Instituto de Botânica. (São Paulo – SP)
Conservação das cepas
O método utilizado para a conservação das cepas é a repicagem em ágar dextrose batata (PDA). o meio deve ser solidificado dentro dos tubos em posição inclinada.
Equipamentos e materiais
Capela de fluxo laminar manutenção de um ambiente estéril
Incubadora Microbiológica - BOD manutenção e crescimento dos micro-organismos
Tubos de ensaio
repicagem dos fungos
Autoclave
Esterilização
pHmetro
medição do pH
Destilador de água

Ágar PDA
meio de cultivo
Inoculação dos fungos
Para preparação do inóculo deve ser utilizado o meio PDA com pH ajustado. O meio será colocado em erlenmeyers de 250ml de volume, tampado com tampão de algodão e autoclavado.
Suporte e do substrato
Para produção da lactase a partir do
Aspergillus oryzae
, pode-se utilizar uma mistura de farelo de trigo e casca de arroz, como suporte, umidecido com água destilada contendo lactose ou soro de leite, como substrato.
A fermentação deve ser conduzida em erlemeyer de 250 mL contendo 10g de substrato. Todos os erlemeyeres deverão ser autoclavados e após o resfriamento, inocular a suspensão de esporos. Após ser homogeneizado e misturado, o erlenmeyer deverá ser incubado. A amostragem deve ser determinada com tempos, temperaturas e umidades variadas.
FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO
Clarificação
Para a obtenção do extrato enzimático, devem ser separadas 10 g de amostra a qual será misturada a 100 mL de água destilada. Essa suspensão permanecerá sob agitação contínua em shaker de bancada. Em seguida, deve ser feita a filtração para remoção dos sólidos. O extrato obtido foi centrifugado, a fim de separar a massa celular do sobrenadante,
Rompimento celular

Rompimento químico -
Álcalis, detergentes, solventes ou lise enzimática. Esse tipo de rompimento por ser caro, acaba sendo caro para escala industrial.
Rompimento mecânico -
O mais adequado para fungos filamentosos é o moinho de bolas.
Determinação da atividade das enzimas
Existem métodos químicos e calorimétricos para determinação de sua atividade. Que deverão ser avaliados os mais viáveis ao longo da obtenção dos extratos enzimáticos.
Purificação
EQUIPAMENTOS E MATERIAIS
Shaker de bancada
agitação das amostras
Centrífuga
separação de elementos líquidos e sólidos
Papel filtro
Erlenmeyer
Concentração
A concentração da enzima bruta pode ser realizada a partir de precipitação proteíca por sais ou solventes orgânicos, banho maria gelado e centrifugação.
Equipamentos
Espectrofotômetro
Identifica e determina a concentração de substâncias
Banho-maria
aquecer substâncias líquidas ou sólidas no qual não pode ser exposta diretamente no fogo
Pode ser feita uma purificação de baixa resolução (diálise ou ultrafiltração), seguida de uma de alta resolução (cromatografia) . Para determinação da massa molecular da proteína purificada, deverá ser feita uma eletroforese em gel de agarose.
Equipamentos
Cromatógrafo
Separação dos componentes de uma mistura
Cuba Eletroforética
Separação de moléculas e determinação de massa molecular
Considerações Finais
O Brasil vem passando por um período de plena expansão no setor biotecnológico, em que empresas de inovação estão sendo criadas buscando competitividade internacional. Além disso, o enorme potencial da nossa biodiversidade, em que novas espécies de micro-organismos, animais e plantas estão por serem descobertas, poderá trazer melhoria da qualidade de vida da sociedade com novas moléculas e, consequentemente, novos produtos.
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OBRIGADA PELA ATENÇÃO
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