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Prezi

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by

Cristopher Palma

on 26 August 2013

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Transcript of Prezi

Listado de Exámenes de LDCM
Partidores, Oligonucleótidos o Primer
Introducción al diseño de primer y análisis de secuencias
Secuencias cortas de ADN (18-25 bases)
Moleculas lineales con un grupo hidroxilo en el extremo 3' (3' OH)
Secuencias complementarias al ADN blanco
Se unen al ADN molde de acuerdo a la regla de complementariedad.
Reglas generales de diseño de partidores
Asegurarse de que la secuencia utilizada para el diseño de los primers sea la correcta.
∆TM en lo posible < a 3-4 °C (TM desde 55-65 °C)
18-25 bases de largo
Contenido G+C 30-80%
Primer con GC más bajo deben diseñarse más largos para conseguir una Tm por encima de la recomendada
No más de 4 G o C consecutivas por partidor
No más de 2 GC en el extremo 3 ya que contribuye a la estabilidad del final del primer.
Sin G en el 5’
Creación y análisis de partidores
Búsqueda de información de la secuencia
Tener totalmente caracterizado lo que se quiera buscar.
Buscar bibliografía que este validado por una base clínica.
Elegir genes que tengan características que sean útiles y que estén bien caracterizados y con elementos repetidos (ej. Genes Ribosomales en bacterias).
Revisión del gen a amplificar (GenBank: # )
Revisar las secuencias de los partidores utilizados.
Revisar la metodología y resultados de la publicación
Reconstituir los primer
https://www.neb.com/~/media/NebUs/Page%20Images/Applications/DNA%20Amplification%20and%20PCR/pcr.jpg
Partidor sentido
Partidor Antisentido
La secuencia de los primers tiene una influencia importante en la especificidad y la sensibilidad de la PCR. Por ello es importante seguir una serie de recomendaciones a la hora de diseñar los primers.
Tm=69.3+0.41x(%GC) -(650/longitud del primer)
DISEÑO DE PRIMERS
Evitar los primers que pueden formar dímeros o estructuras secundarias.

Diseñar el primer al menos 50 bases “upstream” de la secuencia de interés. La secuencia inmediatamente posterior al primer o no se obtiene o puede ser bastante imprecisa.
Estructura secundaria. Hairpin Loop
Efecto de los dimeros en el Gel de agarosa
Dímeros
Bandas especificas
Los primer llegan liofilizados

Calcular las concentraciones
Preparar las soluciones stock y de trabajo
Prueba de partidores
Estandarización de las concentraciones de primer

Estandarización de la concentración de magnesio

búsqueda de la temperatura óptima de alineamiento
http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/
Alineamiento de Secuencias de interés y arboles filogenéticos
http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/
Alineamiento de partidores
Para medir la especificidad del primer, se procede a realizar un BLAST para ver con que otra secuencia cruza el primer diseñado.
Especificidad del primer
http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/
Oligo Analizer
Untergasser A. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 2012 Aug;40(15):e115. Epub 2012 Jun 22.
Primer3
Blast
Análisis de estructuras secundarias.
Buscar el primer que tenga el menor numero de estas estructuras
Análisis de la temperatura de melting del partidor.
Las TM no deben sobrepasar los ∆3-4°C entre los primer.
http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/
Análisis de oligonucleótidos
http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi
Start: Lugar del 1° nucleótido de la secuencia.
Len: Tamaño del primer
Tm: Temperatura de melting.
CG%: porcentaje de C-G
Any: Homodímeros
3’: Heterodímeros
Rep: %The similarity to the specified Mispriming or Mishyb library.
Seq: secuencia del primer escogido
Primer3
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome
SI
NO
NO
Guardar
Análisis Bioinformáticos
Significativo?
NCBI/BLAST
Secuencias
Blast
http://dna.utah.edu/umelt/umelt.html
UMELT
Es una herramienta de análisis del comportamiento termodinámico del segmento amplificado de ADN (amplicon) el cual nos muestra de manera gráfica la el proceso de denaturación de la hebra de ADN.
Umelt
http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/
HETERODIMEROS
Son dímeros formados por la unión del primer forward con el primer reverse. Observar que el primer diseñado no posea más de 4 enlaces covalentes.
HOMODIMEROS
Son dímeros formados por la unión de un mismo primer. Observar que el primer diseñado no posea más de 4 enlaces covalentes.
Análisis de oligos
Existen muchos programas que nos ayudan a elegir el mejor partidor dentro de una secuencia.
NCBI/BLAST
Significativo?
Análisis Bioinformáticos
SI
Guardar
Query cover: Cuanto de la secuencia problema es cubierta en el alineamiento.

E-value: El parámetro E es conocido como e-valor (e-value) de corte, y nos permite definir qué alineamientos queremos obtener de acuerdo a su significación estadística. Cuanto menor sea el valor de E, más significativo es un alineamiento.
Ta=0.3 x (Tm de primer) + 0.7 x (Tm del producto) - 25
NCBI/Blast
Primer 3
Oligo
Analyzer
Umelt
CLUSTALW
CLCBIO
SEQSCAPE
¿Por que Diseñar Partidores?
Pocos tests incorporados a la clínica a pesar de la continua aparición de test moleculares.
Nuevos oncogenes asociados a cancer, genes supresores de tumores y biomarcadores relacionados a cáncer ,no se han transferido al uso clínico.
Nuevos tests moleculares validados, suplementan o mejoran los métodos estándar de diagnostico
Mucho de los nuevos test moleculares de cáncer, tienen baja reproducibilidad , fallas en su estandarización, son de costo elevado y mucho carecen de validación y significancia clínica.
Representación Esquemática de las Etapas Necesariaspara el Desarrollo de un Test de PCR
IMPLEMENTAR UN TESTDE PCR
Primero se debe determinar:

La utilidad clínica del test
Características de performance analítica
Limitaciones del test e identificar y cuantificar las posibles fuentes de error
Definir el uso pretendido para el test
Determinar las fuentes de variación biológica y analítica.
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