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Cell subculture & Storage

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by

Yongcheol Choi

on 12 April 2014

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Transcript of Cell subculture & Storage

Cell subculture & Storage

Cell subculture는 계대배양 이라고 하며, 동물에서 세포를 떼어 배양접시에서 배양할 경우 어느 정도 증식이 지나 공간이 부족하여 성장 한계에 이르렀을 때 새로운 배양접시로 옮겨 지속적으로 배양하게 하는 방법입니다. 동물에서 세포나 조직을 떼어 처음 배양접시에 담는 것을 일차 배양이라고 합니다. 세포를 배양접시에 배양하게 되면 접시에 부착하여 단층으로 계속 증식하게 되는데 시간이 지나면 배양접시 전체를 차지하여 부착할 공간이 부족하여 증식이 멈추게 됩니다(Contect inhibition). 세포의 증식을 계속하기 위해서는 해당 세포의 일부를 떼어 다른 배양접시에 옮겨주어야 하는데 이것을 이차 배양이라고 하며 횟수를 계속하여 삼차, 사차 배양으로 이어줄 수 있습니다. 이렇게 세포 성장의 대를 이어준다고 하여 계대배양 이라고 합니다.


Cell subculture

Cell subculture는 계대배양 이라고 하며,
동물에서 세포를 떼어 배양접시에서 배양할 경우 어느 정도 증식이 지나 공간이 부족하여 성장 한계에 이르렀을 때 새로운 배양접시로 옮겨 지속적으로 배양하게 하는 방법입니다. 동물에서 세포나 조직을 떼어 처음 배양접시에 담는 것을 일차 배양이라고 합니다. 세포를 배양접시에 배양하게 되면 접시에 부착하여 단층으로 계속 증식하게 되는데 시간이 지나면 배양접시 전체를 차지하여 부착할 공간이 부족하여 증식이 멈추게 됩니다(Contect inhibition). 세포의 증식을 계속하기 위해서는 해당 세포의 일부를 떼어 다른 배양접시에 옮겨주어야 하는데 이것을 이차 배양이라고 하며 횟수를 계속하여 삼차, 사차 배양으로 이어줄 수 있습니다. 이렇게 세포 성장의 대를 이어준다고 하여 계대배양 이라고 합니다.


Contact inhibition은 동물의 세포운동 또는 증식이 다른 세포에 접촉됨으로써 저지되는 현상이다. 2가지 경우가 있는데, 하나는 접시에서 배양한 고등동물세포는 물리적 장애물이나 세포끼리의 접촉으로 세포막을 매개로 하여 세포골격에 변화를 일으켜 세포운동의 방향을 변화시키거나 운동을 감소시키는 것으로 이를 세포운동의 접촉저지라고 합니다. 또 하나는, 정상 섬유아세포나 상피세포는 암세포와는 달리 접시 전면에서 증식이 정지하게 되는데 이를 세포증식의 접촉저지라고 합니다. 이 성질을 이용하여 세포의 증식능을 단위면적당으로 이식한 세포 수(포화세포밀도)로 표시하여 세포의 형질전환 지표의 하나로 이용합니다. 실제로 세포밀도 상승으로 증식 정지된 세포에서 특이적으로 발현하는 분자군이 분리되었으며 그 중에는 항증식작용을 하는 것이 있습니다. 세포끼리의 접촉은 증식정지의 한 원인이고 세포밀도의 상승에 따른 단위세포가 점유할 수 있는 면적이 감소하여 증식을 위한 발판이 상실하는 것도 요인으로 생각할 수 있습니다. 성장은 하지만 증식은 하지 않습니다.


Contect Inhibition

Contact inhibition은 동물의 세포운동 또는
증식이 다른 세포에 접촉됨으로써 저지되는 현상이다. 2가지 경우가 있는데, 하나는 접시에서 배양한 고등동물세포는 물리적 장애물이나 세포끼리의 접촉으로 세포막을 매개로 하여 세포골격에 변화를 일으켜 세포운동의 방향을 변화시키거나 운동을 감소시키는 것으로 이를 세포운동의 접촉저지라고 합니다. 또 하나는, 정상 섬유아세포나 상피세포는 암세포와는 달리 접시 전면에서 증식이 정지하게 되는데 이를 세포증식의 접촉저지라고 합니다. 이 성질을 이용하여 세포의 증식능을 단위면적당으로 이식한 세포 수(포화세포밀도)로 표시하여 세포의 형질전환 지표의 하나로 이용합니다. 실제로 세포밀도 상승으로 증식 정지된 세포에서 특이적으로 발현하는 분자군이 분리되었으며 그 중에는 항증식작용을 하는 것이 있습니다. 세포끼리의 접촉은 증식정지의 한 원인이고 세포밀도의 상승에 따른 단위세포가 점유할 수 있는 면적이 감소하여 증식을 위한 발판이 상실하는 것도 요인으로 생각할 수 있습니다. 성장은 하지만 증식은 하지 않습니다.

1. 80~90% confluent HIRc-B cells in the 5cm culture dish
2. 10cm cell culture dish
3. Micropipet
4. 37 ˚C water bath
5. DPBS
6. DMEM
7. Trypsin-EDTA
8. Conical tube
9. Centrifuge


Materials

Trypsin 부착세포의 계대배양시 dish의 matrix와 attachment protein을 degration 시키는 prteolytic enzyme입니다
. Trypsin을 처리시 dish에 부착된 cell들을 dish와 분리시켜서 모을 수 있게 해줍니다. 앞서 말했듯이, trypsin은 단백질분해효소이므로 펩티드사슬을 끊는 endopeptidase의 하나입니다. L-arginin 또는 L-lysine의 peptide bond의 에스테르의 카르복시기 쪽을 가수분해 시켜줍니다. 최적 pH는 8이다. Trypsin의 저해제(inhibitor)로는 중금속들, FBS(소의 태아혈청), DFP등이 있습니다.




EDTA 이온응집 요소이며, 화학식으로는, C10H16N2O8,에틸렌디아민테트라아세트산 이라고 합니다. 무색 결정성 분말이며 녹는점은 240˚C입니다. 대부분의 금속이온들과 chelate를 만들 수 있습니다. 이런 chelate들은 침전하지 않는 특징이 있습니다.


*Chelate : 1개의 분자 또는 이온에 2개 이상의 배위원자를 갖고, 그것이 금속 원자(이온)를 둘러 쌓듯이 배위한 고리구조(킬레이트 고리라고 한다)가 있는 화합물. 킬레이트 화합물이라고도 한다. 5, 6원자 고리가 있는 킬레이트는 특히 안정하다. 킬레이트는 그리스어에서 게의 집게(chela)에 유래한다. 생물체 중에서는 헴과 금속 단백질 등 중요한 역할을 하는 것이 많다.

Trypsin-EDTA

1. DMEM과 DPBS를 37˚C로 water bath에서 데워준다.
2. Culture dish 를 살짝 기울여서 micropipet으로 배지를 제거 해준다.(5ml)
3. DPBS를 반 병씩 부어서 두 번 세척한다.
4. Cell이 마를 수 도 있기 때문에 재빨리 Trypsin-EDTA 500μl를 넣고 5분간 기다린다.
(가만히 기다리기 보다는 디쉬를 흔들며 살짝 툭툭 쳐서 cell이 잘 떨어질 수 있도록 도와준다.)
5. 떨어진 cell이 어떻게 되어 있는지 microscope로 관찰한다.
6. 500μl DMEM을 넣어 Trypsin-EDTA를 중화시켜준다.
7. Culture dish를 살짝 기울여서 Micropipet으로 cell들을 구석구석 잘 떼어준다.
8. Total 1ml의 cell이 들어있는 용액과 4ml의 DMEM을 tube에 넣어준뒤 Centrifuge에 1,200rpm으로 5분간 돌려준다.
9. Centrifugation을 하는 동안 10cm cell culture dish에 DMEM을 9ml 넣어서 배지를 만들어 준다.
10. Centrifugation 후에 supernatant를 pellet이 같이 안 버려지게 조심히 버려주고 DMEM을 1ml 넣고 pipet을 이용해서 뭉친 cell을 풀어준다.(기포가 생기지 않도록 부드럽게 해준다.)
11. 풀어준 cell을 미리 준비한 10cm dish에 골고루 나선을 그리며 부어준다.
12. Micoroscope로 관찰한다.


Methods

Cell을 실험에 사용할 때마다 계속 배지에 키우기에는 많은 불편함이 따른다. 그렇기 때문에 cell의 손상을 최소화하고 cell의 활성을 최대한 줄인 상태로 다음 실험에 사용할 수 있게 초 저온에서 cell을 저장한다.
Cell을 저장할 때 주의할 점은 cell의 대부분은 물로 이루어져 있기 때문에 얼렸을 경우 뾰족한 ice crystal이 생겨서 membrane을 손상시켜 cell lysis가 일어날 수 있다. 그 것을 방지하기 위해 cell과 함께 넣는 저장용액에 glycerol 또는 DMSO 등의 cryoprotective agent 를 반드시 첨가한다. (DMSO는 최종 volume의 5~10% 되도록 첨가하는데 적정 사용량은 cell line에 따라 다르다.)
*DMSO : (CH3)2SO, 다이메틸설폭사이드 DMSO는 무색무취의 흡습성의 액체로 각종의 유기물질에 대한 뛰어난 용제이다. 동해보호제로서 배양세포 등의 동결보존에도 사용되고 있다. 세포 내,외부에 얼음 결정이 생기는 것을 방해하여
얼음결정으로부터 오는 세포 구조 손상이나 삼투압 스트레스 등으로부터 세포를 보호하는 역할을 한다.


Cell Storage

1. 70~80% Hirc-B cells in 10cm cell culture dish
2. DMEM(complete DMEM 5ml and free-serum 3. DMEM 5ml)
4. DPBS 10ml
5. Trypsin-EDTA 1ml
6. 10~15% DMSO 500μl
7. 20~25% FBS 1ml
8. 1~1.8ml cryovial x 2

(in addition to that)
Micropipet, 5ml conical tube, 37˚C water bath, microscope, centrifuge,
-70˚C deep freezer, -196˚C nitrogen tank

Materials

Methods

1. DMEM,PBS, Trypsin-EDTA를 37˚C water bath에 데운다.
2. Cell culture dish에 있는 DMEM을 제거한다.
3. PBS로 두 차례 dish를 씻어준다.
4. Trypsin-EDTA를 1ml넣어서 cell을 띄운다.(10cm dish 이므로 1ml 첨가)
5. Complete DMEM 1ml을 dish에 넣는다.
6. 2ml의 cell이 든 용액과 3ml의 DMEM을 tube에 넣고 총 5ml의 내용물을 1,200rpm으로 5분 동안 centrifugation한다.
7. Cell을 centrifugation하는 동안 cell을 저장할 때 사용할 storage medium을 만든다.
Free serum DMEM : FBS : DMSO = 7 : 2 : 1 = 1400μl : 400μl : 200μl
*centrifugation을 마친 cell에 DMEM을 1ml 넣으므로 medium에는 DMEM을 400μl 만 넣는다.
8. Centrifugation을 마친 tube의 supernatant를 버리고 1ml의 DMEM을 넣고 pipet을 이용해 부드럽게 single cell로 만들어 준다.
9. 8의 과정이 끝나면 미리 만들어 놓은 storage medium에 옮긴다.
10. 2개의 Cryovial에 1ml씩 나눠 담는다. (vial에 너무 가득 넣으면 contemination의 위험이 있기 때문이다. 그리고 labeling을 꼭 해준다. Cell의 이름, 날짜, dish에서의 배양상태 등)
11. -70˚𝐶 Deep-freezer에 24hr 보관한 뒤 -176˚𝐶 nitrogen tank에 옮긴다.
*갑자기 nitrogen tank에 들어가면 cell이 이 손상되는 정도가 커지기 때문에 천천히 얼린다.
Full transcript