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Radioimunoensaio

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by

Ana Gabriela Romboli Graça

on 29 September 2015

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Transcript of Radioimunoensaio

Sistema Imunológico
Radioimunoensaio
Antígeno é qualquer substância, normalmente proteínas, reconhecidas como estranhas pelo organismo, o qual arma uma resposta imune contra este antígeno. Os antígenos podem ser, por exemplo, uma proteína do envoltório viral ou da membrana de uma bactéria.
Anticorpos são proteínas que reconhecem um antígeno de forma específica e com alta afinidade.

Antígenos e
Anticorpos
Após uma infecção, algumas células de memória são formadas para produzirem continuamente uma baixa quantidade de anticorpos e também para produzirem novamente altas doses no caso de uma nova infecção. Esse é o princípio utilizado nas vacinas.

Vacina e Células de Memória
Um dos métodos mais sensíveis para análise quantitativa das reações antígeno-anticorpo.

Usa o antígeno marcado radioativamente e anticorpos para determinar a concentração de antígenos com uma precisão bastante elevada, sendo bastante usada para a determinação da concentração de hormônios.

Radioimunoensaio
Tipos de RIA
Testes que necessitem de alta sensibilidade: permite dosagem de substâncias não encontradas em concentrações suficientes para serem percebidas por outras técnicas;
Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue;
Polipeptídios, catecolaminas, esteroides, antibióticos, hormônios tireoidianos, proteínas e vitaminas;
Pesquisa;
Marcador tumoral;
Pesquisa de drogas na urina ou soro de atletas.

Aplicações
Histórico
1934- Collip e Anderson , descreveram a presença e ação dos anticorpos;
1950 -A física Rosalyn Sussman Yalow e o médico Salomon A. Berson , iniciaram um amplo projeto de estudo sobre o emprego de radioisótopos em medicina;
1960- Yalow e Berson, conseguiram desenvolver um método de doseamento de insulina;
1963- Empregaram o radioimunoensaio para dosar vários hormônios;
1977 – Yallow ganhou o prêmio Nobel.

De Competição com
Ag Marcado
De Competição com
Ac Marcado
Sanduíche ou
Captura de Ag
Para detecção de Imunoglobina E (IgE)
Paper Radioimmunosorbent
Test (PRIST)
Radioallergosorbent Test
(RAST)
Inicialmente, uma quantidade conhecida de anticorpos específicos é colocada na fase sólida.
Em seguida, adiciona-se o antígeno marcado com 125 I.
Uma amostra de soro de um paciente suspeito é acrescentada.
O antígeno, se presente no soro, compete com o antígeno radioativo pelos locais de ligação nos anticorpos.

A concentração das moléculas antigênicas presentes na amostra é inversamente
proporcional à leitura de radioatividade.
A quantificação é feita em aparelho específico para a leitura de radioatividade.
Inicialmente, antígenos são fixados na fase sólida.
A seguir, acrescenta-se a amostra do paciente.
Os anticorpos específicos e marcados com o radioisótopo são acrescentados.
Se a amostra for positiva, haverá a formação do complexo Ag/Ac com o Ag do soro.

Quanto maior a quantidade de antígeno na amostra, maior será a ligação destes aos anticorpos,
formando imunocomplexos, que serão
retirados por lavagem e assim reduzindo
a leitura da radioatividade.
Teste realizado em duas etapas
Proteção do organismo contra vírus, bactérias e outros micróbios;
Composto por diferentes tipos de células;
Importância vital;
Produção de anticorpos;

Primeira Etapa
1) Fixação de Acs não marcados na fase sólida.
2)Adição da amostra (que contém Ag específicos contra o Ac fixado e outros componentes não específicos).
3) Os Ac capturam os Ag específicos da amostra.
4) Deverá ocorrer uma primeira lavagem para eliminação de componentes não específicos
Segunda Etapa
1) Acrescenta-se um segundo anticorpo específico e marcado, que formará o “sanduíche”.
2) A formação do imunocomplexo será revelada por este segundo anticorpo.
Anticorpos anti-IgE e não marcados são fixados na fase sólida.
Acrescenta-se o soro a ser pesquisado para a presença de IgE. Em caso positivo, haverá a união do anticorpo IgE + anticorpo anti-IgE.
Após lavagem para retirada do excesso de Ac não ligado, acrescenta-se anticorpos anti-IgE marcados com isótopo para que haja a revelação da amostra.
Após lavagem, procede-se com a leitura.
A determinação da concentração de IgE total presente na amostra ocorrerá através de cálculo que relacionará os valores obtidos com uma determinada curva padrão
O alérgeno específico para o Ac IgE pesquisado é previamente fixado ao fundo do tubo na fase sólida.
Acrescenta-se soro do paciente. Havendo presença de IgE específica ao alérgeno em questão, haverá a formação do complexo Ag/Ac.
Acrescenta-se o anticorpo anti-IgE marcado, e este se liga ao Ac IgE pesquisado.
A reação então será revelada através do segundo anticorpo.
Características dos marcadores
I125
É o radioisótopo mais comumente utilizado;
Mais utilizado em radioterapia;
Meia vida de 57,5 dias;
Liga-se facilmente aos resíduos de tirosina das proteínas;
Produz radiação Y (gama);
Estabilidade menor que 3H;
Dosagem de hormônios proteicos.

Trítio (3H)
Produz radiação beta;
Dosagem de esteroides;
Vantagens
Método sensível , específico e de alta afinidade;
Baixo custo;
Requer pouca amostra;
Rápido.
Desvantagens
Instabilidade dos radioisótopos;
Risco operacional;
Necessidade de medidas especiais;
Elevado custo de biossegurança;
Problemas com descarte de material.

Equipamento
Aplicável aos isótopos: I-129, I-125,Co-57, Cs-137;
permite executar testes de radioimunoensaio quantitativos, (RIA e IRMA), semi - quantitativos, qualitativos e de dupla marcação;
Suportes universais;
Software desenvolvido na óptica do utilizador;
Fórmulas matemáticas;
Monitorização dos parâmetros das curvas de calibração
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