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Grundoperationen der Gentechnik

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by

Bianca Brendel

on 3 December 2014

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Transcript of Grundoperationen der Gentechnik

Viren als Vektoren
Plasmide als Vektoren
am gebräuchlichsten für Genübertragung in Bakterien
dafür häufig
konstruierte Plasmide
d.h. aus mehreren natürlichen Plasmiden bestehend
den Versuchen entsprechend zusammengebaut
werden nach Hersteller benannt; z.B.
pSC101
-> Stanley Cohen
Plasmide
=
doppelsträngige DNA-Moleküle;
replizieren autonom;
sind klein und ringförmig;
gehören nicht zum Bakterienchromosom;
in Bakterien und Archaeen zu finden
Gliederung
Einführung in das Thema
Plasmide als Vektoren
Grundoperationen der Gentechnik:
Übertragen von DNA

Einführung in das Thema
Direkte Genübertragung
Quellen
rekombinante DNA
= neu zusammengesetztes künstliches DNA-Molekül
kann nur in ein
Genprodukt
, z.B. Protein umgewandelt werden wenn es über eine Wirtszelle verfügt
dafür die Transportvehikel Vektoren genutzt; durch
Transfektion
oder
Transduktion
DNA in Wirtszelle übertragen
Vektoren
= DNA-Moleküle mit bestimmten Eigenschaften; z.B. Plasmide oder Viren
müssen
replizierbar
sein (d.h. bestimmte Sequenz zeigen, wo Replikation beginnt bzw. den
Replikationsursprung
)
auch bestimmte Verfahren zur direkten Übertragung
häufig verwendetes Plamid =
pBR322
besteht aus einem Plasmid aus
E. coli
mit Replikationsursprung
Resistenzgen gegen Antibiotika
Tetracyclin
aus
pSC101
Resistenzgen gegen Antibiotika
Ampicillin
beide Resistenzgene enthalten Schnittstellen für verschiedene
Restriktionsenzyme
=Restriktionsendonukleasen (REN); können bestimmte Positionen an DNA erkennen und schneiden; zur Phagenabwehr in Bakterien und Archaeen
Viren als Vektoren
Direkte Genübertragung
Quellen
Biologiebuch
Wikipedia
beim Einschleusen von Fremdgenen in Pflanzenzellen häufig Plasmid aus Bodenbakterium
Agrobacterium tumefaciens
verursacht Tumore bei zweikeimblättrigen Pflanzen (z.B. Sonnenblumen, Lavendel)
auf Plasmid Gene, die Gentransfer und Tumorwachstum steuern =
Ti-Plasmid
Tumor induzierend bzw. auslösend
zum Verhindern von Tumorbildung; beteiligte Gene entfernt, durch erwünschte ersetzt
verschiedene Restriktionsenzyme und ihre Schnittstellen
Transduktion
Transfektion
da
Agrobacterium tumefaciens
auf zweiblättrige Pflanzen spezialisiert, kein Ti-Plasmid bei einkeimblättrigen, z.B. Orchidee oder Lilie, möglich
deswegen spezielle Viren als Vektoren
Nachteil:
Vektor-Viren mit Fremdgen häufig nicht in Genom der Empfängerzelle integriert
Infektion mit Virus kann die Pflanze schädigen

bei Gentransfer auf Tierzellen meist
modifizierte
Viren genutzt
vor allem
Retroviren
(z.B. HIV) bei Wirbeltieren verbreitet
Erbsubstanz aus RNA
durch
reverser Transkriptase
und
Integrase
verankern Retroviren ihr Genom stabil in Chromosom der Wirtszelle
vor allem in Pflanzenzucht, aufgrund von Problemen im Vektorsystem
Grundlage:
Protoplasten
kultur
Verfahren beruhen auf Weg der DNA durch Zellembran& Kernhülle in den Zellkern
am einfachsten
Fremd-DNA durch
Endocytose
in Protoplasten aufgenommen
Erleichterung der Aufnahme:
Polythylenglykol (PEG)
Substanz; ursprüngliche Fuktion: Fusion von Protoplasten
Inkubation
Elektroporation
für wenige Millisekunden hohe Spannung
dadurch Poren in Zellmebran
DNA hindurchgeschleust
Partikelbeschuss
engl.: gene-gun
Gold- oder Wolframkügelchen
ca. 1-3 µm Durchmesser
mit Fremd-DNA überzogen
mit hoher Geschwindigkeit in Pflanzenzelle geschossen
Mikroinjektion
bei Tierzellen
Fremd-DNA durch feine Holznadeln oder Mikrokapillare in Zelle injeziert
auch bei
Gentherapie
Mensch angewandt
Video-Partikelbeschuss (optional)
Weitere mögliche Vektoren
Cosmide:
durch Einbau von
cos-sites
aus
λ-Phagen
in Plasmide erhält man Cosmide
Vorteil: gegen Plasmidvektoren viel kürzer
dadurch höhere Aufnahmekapazität
können sogar längere Abschnitte als Phagenvektoren bilden
werden wie Bakteriophagen verarbeitet
verhalten sich in Wirtszelle aber wie Plasmide
sehr attraktiv; allerdings schwer zu handhaben
Phagemide
:
Plasmid, welches einen
origin of replication zur einzelsträngigen Replikation von f1-Phagen
trägt
Hybridvektor
aus Plasmid und Phage
wenn Phagemid in Form eines Plasmids in der Zelle vorliegt, können darauf liegenden Gene exprimiert werden
Keimzellen:
spermienvermittelter Gentransfer
bei einer künstlichen Befruchtung DNA so in Eizelle eingeführt
Weitere mögliche Vektoren
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