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뿌리혹박테리아의 효율성 탐구와 종 분석을 통한 더 큰 효율성 얻어내기

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현준 여

on 13 February 2015

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Transcript of 뿌리혹박테리아의 효율성 탐구와 종 분석을 통한 더 큰 효율성 얻어내기

뿌리혹박테리아의 효율성 탐구와 종 분석을 통한 더 큰 효율성 얻어내기
탐구 동기
평소 우리는 식물이 토양자원을 착취한다고 묘사해왔지만, 식물과 토양은 2가지 상호관계를 갖는다. 뿌리에서 분비되는 분비물은 뿌리 부근에 다양한 미생물을 지원하며, 죽은 식물은 토양 미생물에게 필요한 많은 에너지를 공급한다. 이러한

뿌리와 세균이나 곰팡이와의 상호관계인
상리공생

편리공생
에 대해 알아본다. 더 나아가

이러한 세균이나 곰팡이와
비상호관계에 있는 희귀식물
에 대해 살펴보고

이 식물들에게
질소고정 공생관계
와 같은
이로운 효과를 연결
시킬수 있는 방법을 탐구해 보고자 이 탐구를 진행하게 되었다.
연구 내용
1. 콩과식물 - Rhizobium 공생과 상업적 비료의 효율성 비교
이론적 배경
캠벨 9판에 따르면 식물에서의 콩과식물-Rhizobium 공생은 현대의 상업적 비료보다 훨씬 유용한 질소를 생산하며, 이러한 공생관계는 농부들에게 어떤 경비도 부담하지 않으면서 농작물에 적당한 양의 질소를 제때에 공급할 수 있도록 한다. 또한 공생적 질소고정은 콩과식물에 질소를 공급할 뿐만 아니라 연작작물의 비료사용을 줄이는 효과가 있다고 한다.
농업에서는 공생적 질소고정으로 인한 효과를 윤작(crop rotation)에서 얻을 수 있다. 옥수수같은 비콩과류 식물을 일년간 경작 한 다음 해에는 알팔파나 다른 콩과 식물을 심어 토양의 고정 질소 함유량을 회복시킨다. 콩과식물이 특정한 Rhizobium과 만나게 하기 위해서 파종 전에 종자를
세균배양액
에 넣거나 세균의 포자를 종자에 묻히는 방법이 사용된다. 콩과작물을 수확하는 대신 밭을 갈아엎으면 이들이 “녹색거름” 으로 분해되어 화학비료에 대한 요구량이 줄어든다.
콩과식물 이외에도 많은 식물이
공생적 질소고정 이외의 이점
을 이용하고 있다. 예를들면 오리나무와 어떤 열대 초본식물은 방선균류에 속하는 그람양성균의 숙주가 된다. 상업적으로 대단히 중요한 벼는 공생적 질소고정으로 인한 혜택을 받고 있다. 벼농사를 짓는 농부들은 수생 양치식물의 하나인 개구리밥을 벼와 함께 키운다. 개구리밥과 공생관계인 남조류는 공기중의 질소를 고정하여 논의 비옥도를 높이는 역할을 한다. 벼가 자라서 그늘을 만들면 개구리밥은 죽게되는데 자연히 이들 유기물질은 분해되므로 논의 비옥도는 더 증가한다.
토양과 근권 미생물
이론적 배경
토양은 박테리아, 세균, 원생생물, 조류 등을 포함한 많은 미생물들이 사는 복잡한 서식처를 제공한다. 토양 미생물중의 1~10%는 그들의 생활환경과 같은 토양에서 인위적으로 배양할 수 있다. 그 중에서 박테리아는 토양 미생물 중에서 수적으로 가장 풍부하다. 토양 미생물들은 자유생활이나 토양의 표면에 부착된 상태로 발견된다. 한편 많은 수의 토양 세균들은 식물의 뿌리와 상호작용을 하는데 이를 근권이라 한다. 근권은 흔히 내부 근권, 표면 근권 그리고 외부 근권으로 나뉜다. 이들의 구획은 식물의 뿌리조직, 뿌리표면, 토양으로 나눠진다. 이들 근권으로부터 떨어진 토양을 무균 일반토양이라고 한다. 뿌리 공생 균근균은 균권에서 무균 일반토양과 식물뿌리 사이를 연결해 주는 데에 중요하다. 이들은 주변의 토양에서 발견되는 세균보다 식물의 뿌리를 둘러싼 토양에서 더 많이 관찰된다. 또한 이들 사이의 관계는 다른 고등 미생물의 생장과 활성을 촉진시킨다. 이들 고등 미생물의 생장을 촉진시키는 주요 이유 중 하나는 식물 뿌리로부터 분비하는 가용성 유기화합물이다. 이 유기화합물의 대부분은 탄소화합물 단당류, 아미노산, 당이다. 그러나 이들 뿌리 분비물의 구성과 양은 식물의 종, 물 함량과 온도와 같은 조건에 따라서 다르다. 이 근권 미생물들은 식물호르몬의 생성을 통해서, 혹은 뿌리의 물리적인 상처에 의해서 뿌리 분비물의 양을 증가시킨다.
일반적으로 영양분이 풍부한 근권은 많은 수의 이롭거나 해로운 박테리아, 균에 의해서 균사체를 이루고 식물의 생장과 발달, 생산성을 증가시키는 것으로 생각된다. 세균, 균, 뿌리 사이의 많은 상호작용은 식물체에 있어서 이롭거나 해롭고 중성적인 효과를 가지게 된다.
이들의 관계는 아래 그림과 같이 공생적 상호작용의 유형과 토양 조건에 의존한다.
ex) 강낭콩 뿌리혹의 발달
각 콩과식물들은 Rhizobium의 특별한 계통과 관련이 있다. 옆의 그림은
어떻게 세균이 침투사라고 하는것을 통해 침투 한 다음 뿌리혹으로 발달하는지를 기술하고 있다. 콩과식물과 질소고정 세균 사이의 관계는 상호공생적이다.
왜냐하면 세균은 고정된 질소를 공급하지만 식물은 세균에게 탄수화물과 다른 유기화합물을 공급하기 때문이다. 공생적 질소고정에 의해 생산된 대부분의 암모늄은 뿌리혹에서 아미노산을 만드는데 사용되고 이들은 물관부를 통해 지상부로 옮겨진다.
그렇다면 어떻게 콩과식물들은 토양속의 많은 세균 가운데 특정한 Rhizobium 세균을 인식할까? 또한 특정한 Rhizobium을 만나면 어떻게 뿌리혹을 발생시킬까?
각 동반자는 상대편으로부터 오는 화학적 신호에 대해 뿌리혹 형성에 관여하는 특정 유전자를 발현함으로서 상대방에게 반응한다. 뿌리혹 형성에 관한 분자생물학적 지식을 이해함으로서
연구자들은 Rhizobium을 유도해 정상적으로 질소고정 공생관계를 갖지 못하는 작물에서 뿌리혹을 형성 할 수 있기를 희망하고 있다.
비콩과식물의 근류형
콩과식물 이외에도 오리나무, 소귀나무, 보리수나무, 소철, 젖꼭지나무 등에 근류가 형성되는 것이 예부터 알려져 왔으나, 이들 대부분은 경제적 가치가 낮고, 더욱 내생균의 분리가 곤란하여, 별로 연구되지 않고 있었다. 최근 지구상의 질소순환의 견지에서 이들 비콩과 근류식물의 종류와 분포에 의한 공생질소고정의 중요성이 인식되었다.
① 비콩과식물의 근류형
ⓐ 오리나무형 : 근류 내생균은 방선균 혹은 이에 가까운 균으로서 대부분의 근류는 공생질소고정능력이 있다.
ⓑ 소철형 : 근류내생균은 남조류의 일종이고 근류 밑 내생남조 단독으로도 질소고정능력이 입증된 것이 많다.
ⓒ 나한송형 : 사상균이 공생하고 있다는 균근설이 유력하나 방선균, 세균류의 존재도 주장되고 있고, 근류의 질소고정능력에 대해서도 명확하지 않다. 연구자에 따라서는 균근으로도 취급하고 있다.
ⓓ 콩과형 : 콩과식물의 근류에 닮은 비콩과식물의 근류를 말하고 지금까지 여러 종류에 대해서 많은 보고가 있으나 부정적인 것이 많다. 이 형에 속하는 근류로 인정되는 것이 최근에 발견되었고, 콩과 근류균(Rhizobium 속)과 공생하는 느릅나무 과에 속하는 Parasponia rugosa와 P. parvifolia의 두 종류의 근류가 있다.
2. 콩과식물에 따른 뿌리혹박테리아의 종 분석
대구 일과학고등학교
2반 김현성, 박지연, 여현준

실험 계획
실험1.
멸균된 흙, Rhizobium 세균 배양액이 첨가된 흙, 비료가 첨가된 흙에서의 완두콩의 성장정도 비교
실험 2.
더 탐구해 보고 싶은 점
준비물: 멸균된 흙90L, 격리 배양용 상자 3개, Rhizobium세균 배양액36ml*6개, 질소비료300g
실험과정:
1. 3개의 상자에 각각 멸균된 흙10L, 멸균된 흙10L+Rhizobium세균 배양액36mL2개, 멸균된 흙10L+화학비료100g 을 넣는다.
2. 각각의 상자에 완두콩을 2개씩 심는다.
3. 하루에 1번씩 한 완두콩마다 물을 200mL씩 준다.
4. 완두콩이 자라는 정도를 (성장속도, 줄기 두께, 길이, 열매의 수)에 관하여 관찰한다.
5. 위 실험을 3번 반복하여 평균값을 구한다.
Rhizobium 세균 배양액 만들기
1. 뿌리혹 박테리아 를 추출해낸다.
2. 추출해 낸 뿌리혹 박테리아를
PDA배지
를 사용하여 배양하고 군체를 형성시킨다.
3. 생성된 군체를 배양액에 넣고 배양시킨다.
4.36mL씩 영양제용 통에 담는다.
*PDA 배지
=감자한천배지
감자와 dextrose의 영양분과 한천의 고체화 성질을 이용하여 미생물을 배양하는 배지
PDA배지의 제조
① 비커 500㎖와 메스실린더 1000㎖, 삼각플라스크 500㎖를 세제로 깨끗이 씻는다.
② 저울을 이용하여 PDA(Difco)배지 가루를 19.5g으로 맞춘 후 비커에 넣는다.
③ 증류수 500㎖를 메스실린더에 담고 비커에 있는 PDA배지 가루를 용해시킨다.
④ 완전히 용해시킨 PDA용액을 삼각플라스크 안에다 담고 3겹의 호일로 밀봉한다.
⑤ 고압 멸균기(Auto clave) 안에 삼각플라스크를 넣고 120℃의 고온․고압으로 30분간 가열한다.
⑥ 고압 멸균기 안에서 삼각플라스크를 조심스럽게 꺼낸 후 크린벤치에서 식힌다.
⑦ 크린벤치 안에서 살균된 페트리 접시(시판용)에 PDA용액을 붓고 이를 굳힌다.
. 여러가지 콩과식물 뿌리혹의 유전자를 전기영동과 서던블롯팅을 이용하여 분석해본다.
1. 뿌리혹박테리아 DNA 를 제한효소로 절단한다.
2. 이 절단체를 아카로스젤에서 전기영동하여 크기에 따라 다양한 절편으로 분리한다.
(아카로스는 넓은 크기 범위의 DNA를 분리하는데 좋은 매체임)
3. 서던블롯팅으로 DNA를 니트로 셀룰로스 필터로 옮긴다.
4. DNA절편을 가열하여 영구적으로 니트로 셀룰로스 필터에 결합하게 한다.
(DNA-DNA혼성화 : 두개의 단일가닥 사슬을 서로 붙여 이중가닥 사슬을 만들면서 두 사슬 사이의 상호성을 검정하거나 상보적인 염기배열을 갖는 염기사슬 혹은 유전자를 찾는방법)
서던 블로팅
[Southern Blotting]
유전자 구조의 해석을 위해 젤전기영동으로 분획된 DNA 단편을 니트로셀룰로오스 등의 멤브레인에 옮긴 후, 특정 염기서열을 지닌 단편을 검출하는 기술.
각 식물의 뿌리혹박테리아종을 알아낸것을 통해 왜 그러한 결합을 했는지 더 탐구 해 보고 싶다.
다른 각각의 식물과 다른 종의 뿌리혹박테리아를 결합시켜 더 좋은 질소 생산 효율성을 가져올 수 있는 식물을 만들고 싶다.
Thank You
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