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Copy of Plantes Transgéniques (final)

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by

KaOu Chelsea

on 13 May 2014

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Transcript of Copy of Plantes Transgéniques (final)

1986
1990
2014
1999-2003
1973
Production d'hormone de croissance dans du tabac et culture en suspension de cellules de l'EPO.
Accords internationaux & création d'agence de veille sanitaire : (AFSSA) ANSES en France
Identification du plasmide Ti dans la bactérie
Agrobacterium tumefaciens
Historique
Production de Protéines recombinantes
Conditions de transformation d'une plante
Techniques de transformations
Deux techniques qui permettent d'introduire l'ADN dans les protoplastes :
Processus naturel
La biolistique :
Voie directe
Avantages :

- Simple d’emploi
- Obtention de bons résultats


Inconvénients :

- Transformation partielle
- Plusieurs gènes peuvent s’insérer dans une même cellule.

Transfert sur les Protoplastes :
voie directe
Méthode chimique : Utilisation du PEG
Méthode physique : éléctroporation
Deux méthodes méthodes simples mais efficaces
Inconvénients
:
- Altération de la structure de la plante
Perte de fertilité
Transformation grâce à
Agrobacterium tumefaciens
Voie indirecte
dite biologique
Qu'est-ce qu'une plante ?
Qu'est-ce qu'une plante transgénique ?
Introduction
Rappels & définitions

Principe de la Transgénèse
Production de protéines recombinantes
Domaines d'applications & Enjeux

Conclusions

Dans une plante
En culture cellulaire de plante
Enzymes
Enzyme de conversion de l'Angiotensine, Protéine C (anti-coagulant)
Protéines sanguines et plasmatiques :

Albumine, Collagène
Enképhaline
Hémoglobine
Vaccins
Choléra, Grippe, Hépatite B, Paludisme
Anticorps

IgG
IgA
Hormone, cytokines, facteurs de croissances
Somatotropine (hGH), EPO, EGF
Protéines thérapeutiques
Innovation !
Méthode de Magnifection
Vecteurs viraux utilisés
AttB : Site de recombinaison
DsRED
: red fluorescent protein (Discosoma)

GFP
: Green Fluorescent Protein
LB and RB : Bordures gauches et droite
Int : intron


Coexpression de TMV et PVX dans la même cellule

Construction du vecteur viral PVX codant pour la GFP

Construction du vecteur viral TMV codant pour la DsRED

Nicotiana benthamiana

Méthode d’agroinfiltration
:

Coexpression de TMV et PVX dans la même cellule

Agrobacterium

Vecteurs viraux déconstruits

Coexpression de TMV et PVX dans la même cellule

Coexpression de la GFP et DsRED dans
95%
des cellules.
TMV & PVX se répliquent au sein de la même cellule avec une grande efficacité.

Coexpression de GFP et DsRED dans les feuilles de
N. benthamiana
à l'aide de vecteurs viraux.

Production de la protéine d’intérêt : Immunoglobuline G

Production de la protéine d’intérêt : Immunoglobuline G

AttB : Site de recombinaison
A5 LC : Light chain = chaîne légère
A5 HC : Heavy chain = chaîne lourde
T : site Terminateur
LB and RB : Bordures gauche et droite
Int : intron
SP : Peptide Signal


Construction du vecteur viral PVX codant pour la chaîne lourde de l’IgG

Construction du vecteur viral TMV codant pour la chaîne légère de l’IgG

Agrobacterium

Méthode d’agroinfiltration

Accumulation des chaînes légères et lourdes, LCs et HCs dans les feuilles de
N. benthamiana
coinfectées par les provecteurs TMV and PVX. La chaîne légère (LC) est exprimé avec PVX et la chaîne lourde (HC) avec TMV.

U: uninfected tissu
S: A5 standard
L : LC exprimée seule dans TMV
H: HC exprimée seule dans TMV

Les protéines sont séparées sur un gel de polyacrilamide (12%) en conditions réductrices

Analyse par Western Blot

Production de la protéine d’intérêt : Immunoglobuline G

Protéines séparées sur gel de polyacrylamide, en conditions non réductrice avec du Bleu de Coomassie

Accumulation d'Anticorps A5 dans les feuilles de N.benthanamia co-infectées avec le vecteur TMV exprimant la châne HC et le vecteur PVX exprimant la chaîne légère LC.

Anticorps anti-IgG (chaine gamma)
Anticorps anti-IgG (chaine lambda)

OU

L’IgG obtenue est-elle fonctionnelle ?

Production de la protéine d’intérêt : Immunoglobuline G

Utilisation de billes magnétiques de protéine A

Purification de l’IgG

Les données montrent que l’immunoglobuline G obtenue est fonctionnelle.

Technique d’ELISA : estimation de l’activité de l’anticorps sur l’antigène.

Schéma général de la production d'une protéine recombinante
Fonctions des virus


Infection de l'hôte
Amplification et réplication de l'acide nucléique
Assemblage des virions matures
Mouvement cellules à cellules
TMV
:
Tobacco Mosaic Virus
Virus à ARN infectant les plantes : le tabac.
PVX
: Potato Virus
Virus à ARN responsable de la mosaïque de la pomme de terre.
Méthodes d'analyses
Analyse par SDS PAGE
Analyse par Western Blot
Analyse par SDS PAGE
Anticorps anti-IgG (chaine gamma)

Anticorps anti-IgG (chaine lambda)

Production de la protéine d’intérêt : Immunoglobuline G

L’IgG obtenu est-elle fonctionnelle ?

Avantages & Inconvénients
Risques liés à l'utilisation de plantes transgéniques
Coût
Polyvalence
Meilleur
Rendement
Avantages
Inconvénients
Long à concevoir
Voici une liste non exhaustive des protéines qui ont été produites à l'aide de ce système d'expression :
Domaines d'applications
La transgénèse
Modification du génome Par introduction d'un gène provenant d'un autre organisme.
Transcription
puis
traduction
par la machinerie endogène de la cellule végétale = On parle d'
Organisme génétiquement modifié
(OGM)

Blé au Moyent Orient il y a 4000 ans
XXème siècle : Loi de Mendel
Génie génétique : Le clonage
1983-85
1ère plante transgénique(le tabac) qui résiste à un antibiotique puis à un insecte
Les Etats-Unis commercialisent la Tomate Flavr Savr
170 millions d'Hectares cultivés à l'heure actuelle
Coton

Tabac
Soja
Les Plantes transgéniques
Chromatographie d'affinité
Etapes de production
Cals transgénique de tabac
Promoteur 35S
Marché des plantes transgéniques
60 Milliards de dollars
Deux approches de cultures cellulaires
Chevelu racinaire
Suspension cellulaire
Espèces cultivées
Arabidopsis thaliana
Taxus cuspidata
Catharanthus roseus
Luzerne
Riz
Pomme de terre
Soja
Colza
Tomates
Cellules sauvages co-cultivées avec
A.tumefaciens
Localisation par marquage fluorescent des protéines de tubuline (en rouge) et des molécules d'ADN (en bleu) dans des cellules végétales de tabac (lignée BY2).INSERM


Coût
Production
rendement
Rapide & en continu
Protéines complexes (proche de )
Pas de contaminants

De plus pour le système cellulaire :
Pas de problème de purification et d'extraction (diffusion via l'apoplaste)
Ciblage précis des tissus


Modification post traductionnelles


- chez les mammifères : ajout de fucose par liaison alpha (1-6) et d'acide sialique
- chez les plantes : ajout de beta(1-2) xylose et du alpha (1-3)-fucose

 Flux de gènes (culture sous serre très contrôlée)
 Risque d'intoxication et potentiels allergènes pour l'homme et les animaux.
 impact sur la rhizosphère par la contamination des sols (non vérifié)
 Variabilité climatique
 Difficulté d’appliquer des normes de bonnes pratiques de fabrication courante (BPFc)
 Filières OGM « thérapeutiques » et chaîne alimentaire doivent être séparées ;
 Polémique OGM et perception du public

Avantages
Inconvénients
Gand (Belgique)
=>Année 1980
=>1ères plantes transgéniques
Risques environnementaux & Risques sanitaires
170 millions d'Hectares cutivés à travers le monde
Quels sont les risques
Toxicologique
Allergène
Transgénèse dans une cellule végétale
:

Insertion du gène d'intérêt et Production de protéines recombinantes
Prévisions démographiques d'ici 2050
Milliard d'habitants
Enjeux démographiques, économiques et environnementaux
Alternative et résolution de la faim dans les pays du Sud

Améliorer la productivité et les rendement des récoltes
Pour une agriculture résponsable
Qu'est-ce qu'une plante transgénique ?
Quelles utilités ?
Y a t-il des risques ?


Réelle Alternative
Développer des procédures en accord avec les Bonnes Pratiques de Fabrication AMM


Risques non négligeables


Problème éthique


Conclusion
Huxley disait :

« Toute science doit parfois être traitée comme un ennemi possible ».

Définir des Limites
Par Qui
Fin
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