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TPE- Histologie et Anatomie Pathologique (1èreS): schématique

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by

Ignacio Vaz-Romero Trueba

on 9 March 2013

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Transcript of TPE- Histologie et Anatomie Pathologique (1èreS): schématique

Archive des patients Répertoire chimique L'Histologie
et
l'Anatomie Pathologique Esther FESNIERES (1S-4)
Ferdinand MARTI (1S-3)
Ignacio VAZ-ROMERO (1S-3) Tissus :
- Faculté Pierre & Marie Curie:
http://www.chups.jussieu.fr/polys/histo/TissusMasson/POLY.Chp.9.html
- http://bio.m2osw.com/gcartable/histologie.htm
- Université de Louvain : http://www.isto.ucl.ac.be/
http://www.isto.ucl.ac.be/oldintro.htm

Histologie :
- Université de Paris : http://didel.script.univ-parisdiderot.
fr/claroline/backends/download.php?url=L2NvdXJzX00xLW1pY3JvZGlzc2VjdGlvbjIwMDkucGRm&ci
dReset=true&cidReq=UE5
- Définition d’acide acétique (bouin):
http://fr.wikipedia.org/wiki/Acide_picrique
http://fr.wikipedia.org/wiki/Acide_ac%C3%A9tique
- Définfition acide picrique
- Définition de protéine : http://www.futura-sciences.com/fr/definition/t/biologie-4/d/proteine_237/
- Livre: Histología, A. Campbell et B. Reece. Editorial Médica panamericana(2005)
- Livre: Histología, citología y microanatomía humanas H. Leonhardt, Ed. Salvat (1975)
- Livre: Histología básica L.C. Junqueira y J. Carneiro Ed. Salvat (1973)
- Livre: Problemas de química general J. Ibarz Ed. Marin (1954)

Microdissection
- Université de Picardie: http://www.u-picardie.fr/plateforme/icap/pres_microdiss.php
- Université de Nantes : http://www.sante.univnantes.
fr/med/histo/enseignement/Ecole%20doctorale/micro%20dissec/microdissection%20laser%20200
9.pdf

Excision :
- Faculté Pierre & Marie Curie : http://www.chups.jussieu.fr/polys/ophtalmo/POLY.Chp.2.2.html

Immunohistochimie :
- http://myrte.u-strasbg.fr/IHC/IHC_en_ligne/Documents/Manuels/IHC/IHC.pdf
Images :
http://www.epathologies.com/acad/presentations/staffs/pathologie/IHC_RCC_0303_Fr.pdf
Définition : http://www.ajol.info/index.php/cmch/article/view/35824
Protocole institut Pasteur :
http://www.pasteur.fr/ip/easysite/pasteur/fr/recherche/departements-scientifiques/infection-etepidemiologie/
unites-et-groupes/histopathologie-humaine-et-modeles-animaux/le-plateautechnique-
d-histologie-humaine-et-animale/recommandations-et-protocoles
+ Protocole Clinicscience : http://www.clinisciences.com/lire/957-fr-
Protocole_general_d_immunohistochimie_(IHC).html
- Cours université Nantes : http://www.sante.univnates.
fr/med/histo/enseignement/Ecole%20doctorale/microc%20photonique/ED%20analyse%20immun
ohistochimie.pdf
- Rappel du système immunitaire:
- http://www.futura-sciences.com/fr/definition/t/medecine-2/d/lymphocyte_187/
- Définition de lymphocyte :
http://dictionnaire.doctissimo.fr/definition-plasmocyte.htm

Le microscope :
-Livre : Physique-Chimie. Enseignement de spécialité de Terminale S. Collection Duraneau-Durupthy.
HACHETTE Education.
- Livre : Microscopía, Werner Nachtigall, Ed. Omega (1994)

Définitions diverses (lexique): Dictionnaire Larousse 2009 Qu'est-ce-que l'Histologie...? L’Histologie est une étude microscopique basée sur l’observation et la description
de différents tissus (analyse de la composition microscopique et de la
fonction du matériel biologique). Ceci permet au docteur spécialisé en anatomie
pathologique (une branche de la médecine de laboratoire) de mieux comprendre
leur fonctionnement et ainsi faire le diagnostic de certaines pathologies
(maladies). Lorsque l’application de l’histologie conduit à la découverte
d’anomalies on parle souvent d’histopathologie. Le Microscope Les tissus Sources et Bibliographie Protocole histologique La fixation www.tpe-histologie-lfb.webs.com Historique 1799 XXème XIXème La médecine de laboratoire a
un grand rôle malgré
son côté inaperçu et parfois
caché dans la médecine /Histo/ < grec = tissu
/logie / < grec = discours (étude) L’anatomie, qui est l’étude de la forme et de la structure des organismes vivants
commence alors à se diviser de façon progressive en anatomie macroscopique
(qui comprend les structures observables à simple vue) et anatomie
microscopique (qui requiert l’usage d’auxiliaires optiques). et l'anatomie Pathologique...? L'Anatomie Pathologique
c'est la pointe de iceberg. La notion de tissu biologique apparaît en 1799 dans l’ouvrage "Traité des membranes en général et de diverses membranes en particulier" de Xavier Bichat.

Un tissu est un rassemblement de cellules ayant la même morphologie (composition identique) et possédant la même fonction (nerveuse, musculaire…). Les tissus biologiques se régénèrent régulièrement et sont assemblés entre eux pour former des organes.
Il existe différents types de tissus dans l’organisme. "Traité des membranes en général et de diverses membranes en particulier" de Xavier Bichat L'italien Marcello Malpighi (1628-1694), professeur de médecine à Bologne et à Pise, est considéré comme le fondateur de l'histologie. XVIIème L'histologie fut d'abord expérimentale, grâce au perfectionnement de microscopes simples, alors récemment inventés, permettant l'étude de coupes minces On commence à parler « d’histologie ». Les techniques histologiques évoluent et atteignent les formes actuelles. Ainsi, par exemple, dans les années ‘70, on assiste à l’apparition de l'histofluorescence (par laquelle on révèle la présence d'une cellule par fluorescence) Microscope de Robert Hooke Les épithéliums de revêtement Les épithéliums glandulaires Le tissu conjonctif Le tissu adipeux Le tissu musculaire En domaine d’histologie on trouve une classification spécifique des tissus. Ils se divisent en tissus simples, composés, et organes. Un assemblage de cellules ayant toutes la même structure forme un tissu simple. Dans la majorité des cas, on observe un mélange de différentes cellules. Ceci forme un tissu composé. Les tissus forment ensemble des organes, prenant place dans un appareil (ou système). Exemple:
Système ou appareil urinaire, respiratoire, cardiaque, appareil de Golgi (ou dictyosomes)… La préparation d'une lame Le prélèvement Attention : Les prélèvements doivent être effectués avec soin, car leur qualité conditionne directement les possibilités d'étude et d’éventuel diagnostic. A) Pour les tissus végétaux B) Pour les tissus humains (catégorie animale) Le prélèvement utilise des méthodes différentes de celles destinées aux tissus d’origine animale (écrasement, empreinte par vernis etc.). On distingue quatre catégories majeures de prélèvement. Les prélèvements sont fréquemment réalisés au cours d'une opération. Il existe également des techniques de prélèvement plus sophistiquées : La Microdissection

À l’aide d’un laser. Cette technique permet de faire une hyper-sélection des cellules à analyser. L'Excision

Une excision est, dans son sens le plus général, le retrait d'une partie de tissu biologique par intervention chirurgicale soit par laser soit par peeling (élimination des cellules mortes de la peau par des produits chimiques). Les biopsies:

Prélèvement de très petite taille d'un tissu, à des fins d'étude microscopique. Les frottis:

Prélèvement médical au moyen d'un écouvillon (*) stérile, d'une petite brosse ou d'une petite Les résections d’organes en intégralité, suivies de leur étude. Les ponctions de liquides:

Prélèvement d’une dose déterminée du liquide (sang, urine, sérum…) afin d’être analysée par la suite. Un écouvillon Glande exocrine
(www.isto.ucl.ac.be ) Epithélium de revêtement superficiel (la peau) Le tissu osseux Tissus conjonctifs non spécialisés Le tissu nerveux Schéma des composants de la cellule Le but de la fixation est de maintenir les tissus ou les organes prélevés dans un état proche de l’état ante mortem en évitant les conséquences de la privation en dioxygène après la mort. La fixation empêche donc à la fois la dégradation du tissu et sa putréfaction. Les fixateurs les plus utilisés ont aussi un effet durcissant. A) Fixation avec produits chimiques Fixateurs + utilisés: - formaldéhyde ou Formol 10%
- Bouin
Danger: Formaldéhyde --> très irritant et responsable d'allergies ou cancers chez l'homme. Leçon d'anatomie du docteur Tulp, Rembrandt (1632) Règles d’Or de la fixation chimique
1) Fixer le plus vite possible après la mort de l’animal ou le prélèvement.
2) Mettre au moins 20 fois le volume de fixateur par rapport au volume de l’échantillon.
3) Immerger l’échantillon dans le liquide fixateur.
4) Utiliser des flacons à fond plat afin d’éviter que l’organe perde sa forme.
6) Laisser fixer 24h à température ambiante.
7) Rincer l’échantillon puis le conserver dans l’alcool à 70° (à température ambiante) Fixation initiale pour les coupes en congélation : dans un milieu froid (cryostat).
Amélioration des coupes avec de l’acétone, du formaldéhyde ou de l’alcool. B) Fixation par congélation Règles d’Or de la congélation d’un tissu en histologie
1) Fixer le plus vite possible après la mort del’animal ou le prélèvement.
2) Enrober l’échantillon avec de l’OCT dans un moule en plastique identifié.
3) Plonger rapidement l’ensemble dans
l’isopentane refroidi par l’azote liquide.
4) La congélation est quasiment immédiate.
5) Mettre ensuite les échantillons congelés, toujours dans leur moule, à -80°C. L'inclusion A) L'inclusion en paraffine L’inclusion : enrober et infiltrer le tissu --> milieu assez dur pour être coupé. C’est le rôle de la paraffine dans le processus histologique usuel. L’enrobage se fait en deux temps :

1) Le remplacement de l’eau par la paraffine après déshydratation par l’alcool, et passage dans le xylène.
2) Le moulage du bloc.
La première étape (ou pré-enrobage) est automatisée, la préparation du bloc est manuelle. C’est une étape critique pour l’orientation finale du tissu dans le bloc et donc sur la coupe. Pour des coupes en congélation, l’OCT est le milieu d’enrobage classique.
C’est un gel à température ambiante, qui devient dur en dessous de -10°C. B) Inclusion par congélation Les coupes Les organes, trop gros pour laisser passer la lumière nécessaire à la microscopie
optique, doivent encore être découpés en lamelles extrêmement fines par un
appareil appelé microtome.

- Avec la paraffine, on peut réaliser des coupes d’une épaisseur de 4-5 um (micromètres) sur
un microtome.
- Le cryostat est un microtome placé dans une enceinte réfrigérée qui permet de
réaliser des coupes congelées d’une épaisseur 8-10 um en général.

Les coupes de 0,05 um seront analysées en microscopie électronique tandis que
les autres seront observées en microscopie optique. Machine du microtome
(Clínica Sagrada
Familia) Inclusion Epaisseur de la coupe OCT Paraffine Résine 5 à 100 um 5-5 um 1 à 0,05 um Les colorations La coloration est utilisée aussi bien pour augmenter le contraste que pour mettre en valeur une structure en particulier A) Colorations usuelles B) Colorations spéciales Coloration histologique usuelle est l’hématoxyline-éosine (HE).
-Hématoxyline : colorant nucléaire (les noyaux en bleu ou noir)
-Éosine colore le cytoplasme des cellulaires en rose orangé. possible association avec du safran qui colore en jaune les fibres conjonctives des tissus (HE&S).

Remarque : Lorsque la coloration est basée sur des réactions chimiques on parle d’Histochimie. Il existe un très large éventail de colorations dites spéciales, monochromes ou polychromes qui mettent en évidence des constituants particuliers des tissus, ou des éléments étrangers tels que les agents pathogènes. Lames préparées --> cuves afin de les colorer

- Déparaffinage éliminer les restes de paraffine.
Lames-->bassins contenant des alcools, des xylènes et finalement dans de l’eau distillée qui les lavent.
- Coloration : Les lames destinées à une biopsie sont
submergées dans l’hématoxyline et dans l’éosine. À la fin de cette étape on
essuie à nouveau avec de l’eau pour éliminer complètement le reste des colorants.
- Finalement les lames passent par des alcools (96º, alcool absolu…) afin de
les déshydrater.
- Clarification dans du xylène pendant 10 minutes. Machine de coloration
(Clínica Sagrada
Familia) La Manipulation des tissus Le poumon manipulé par Ignacio Le fémur manipulé par Esther L’estomac manipulé par Ferdinand Avant de se lancer dans la manipulation d’organes il faut que le pathologiste fasse d’abord une observation à l’oeil nu (observation dite « macroscopique ») de l’organe à étudier par la suite au microscope.

Une infirmière nous a laissé manipuler à chacun d’entre nous différents organes préservés d’anciennes interventions chirurgicales, comme un poumon, un estomac ou un fémur déshydraté. Après le prélèvement délicat d’un échantillon, on procède toujours à le placer dans un moule en PVC qui donnera sa forme au bloc de paraffine. La création d'un bloc de paraffine -Avant le bloc de paraffine : passage de l'organe dans des alcools, xylènes pour le déshydrater et le laisser reposer pendant une douzaine d’heures.
- Submersion de l’organe dans un récipient rempli de paraffine liquide (plus de 55ºC environ) puis congélation pendant une heure environ --> solidification paraffine + fixation organe.

Attention: Avant de l’introduire dans le congélateur l’ensemble doit être refroidi pendant quelques minutes sur une surface froide. Réalisation de la coupe au microtome ou au cryostat Méthode 1 Méthode 2 Découpage précis au microtome du bloc de paraffine (généralement 4 micromètres). On le pose dans récipient contenant de l’eau au bain Marie pour faciliter le dépôt sur une lame de microscope pour teindre. S'il y a urgence: agir le plus vite possible pour amener la lame au pathologiste. Besoin de : congeler, couper et teindre l’organe en même temps. Introduction de l'organe dans le cryostat où il est congelé à l’aide d’un spray froid et fixé à l’aide de laque pour cheveux ( !) puis coupez directement dans un microtome intégré dans le cryostat. Afin de le teindre on utilise une teinture standard appelée Thionine qui teint le cytoplasme des cellules de couleurs bleus voire violets.

Exemple: Congélation d’un pancréas en urgence (le patient étant encore à la salle d’opération). -Fixation de la lame fine de tissu sur une lame de microscope
-Coloration de ces organes --> deux programmes sont utilisés dans ce laboratoire : la coloration par Hématoxyline Eosine (HE) pour les organes prélevés par biopsie, et la coloration par Papanicolaou (ou Vert EA50) pour les cytologies gynécologiques, par exemple. La coloration La fixation finale La coloration étant terminée, la lame mince est enfin recouverte par une lamelle qui protégera la préparation. Pour cela, on utilise certains outils: Notre expérience dans le laboratoire d’Anatomie Pathologique de la Clínica Sagrada Familia, encadré par le Dr. Cases. Ces lames sont analysées puis stockées dans une réserve pendant au moins 5 ans, comme le dicte la loi (tant française comme espagnole). Dès le début de la préparation à chaque lame lui est associé un numéro afin de préserver l’anonymat du patient. Laboratoire d'anatomie pathologique--> microscope optique. Mais il existe des microscopes électroniques de pointe (meilleure résolution)

C’est maintenant au pathologiste de faire un diagnostic prudent pour répondre à la demande des chirurgiens qui ont envoyé l’organe à étudier au laboratoire.

Remarque : Le microscope est l’instrument le plus important dans le domaine
histologique dû à la petite taille des structures analysées. Diagnostics au microscope Pourquoi utilise-t-on les colorations H-E ? A) L'hématoxyline Obtention par l'extraction d’un végétal : le campêche. C’est à l’oxydation que le produit prend sa couleur violette, si on veut être précis.
Sa formule brute est : C16H14O6. On peut trouver également des dérivés de l’Hématoxyline comme l’hématéine de formule C16H12O6 qui se comporte de la même manière. B) L'Eosine C’est un colorant rouge-orangé de formule brute C20H8Br4O5.

Acide --> attraction par les bases. Coloration du cytoplasme et autres membranes.

L'Hématoxyline-Éosine : la + courante des teintes histologiques. On se sert des caractéristiques acidophile/ basophile des colorants et des composants de la cellule. Cette méthode colore le noyau en bleu-noir (hématoxyline) alors que le cytoplasme est coloré en rose (éosine). C) Les composants nucléaires Pour obtenir un contraste suffisant de couleur dans les coupes histologiques on emploie des combinaisons de colorants acides et basiques. L’ADN et l’ARN présentent une forte basophilie pendant que les protéines cytoplasmiques sont acidophiles.

Remarque : pH (Potentiel Hydrogène)
Le pH mesure l’acidité ou la basicité d’une solution. Ainsi, dans un milieu aqueux à 25 °C :
- Une solution de pH = 7 est dite neutre ;
- Une solution de pH < 7 est dite acide ; plus son pH s'éloigne de 7 (diminue) et plus elle est acide. Les ions H+ sont responsables de l’acidité.
- Une solution de pH > 7 est dite basique ; plus son pH s'éloigne de 7 (augmente) et plus elle est basique. Les ions HO- sont responsables de la basicité. Structure de l'ADN Structure de l'ARN L’ADN (Acide Désoxyribonucléique) est une molécule à double brin enroulée sous forme d’hélice. Chaîne composée par : acide phosphorique (P) + désoxyribose (D), (pentose) + quatre bases azotées différentes : l’adénine (A) complémentaire de la thymine (T) et la guanine (G) complémentaire de la cytosine (C). Liaisons hydrogène entre les bases azotées. Nucléotide : acide phosphorique+désoxyribose+base La molécule d’ARN (Acide Ribonucléique) reprend la même structure que l’ADN mais elle présente certaines différences :
- Elle n’a qu’un seul brin
- La Thymine est remplacée par l’Uracile (U)
- Le désoxyribose est remplacée également par du ribose, également une molécule de pentose. Acidophilie --> teindre avec des colorants acides (anioniques).
Basophilie --> teindre avec des colorants basiques (cationiques).
Colorant acide (anionique) --> lien électrostatique (ionogène) avec un groupe tissulaire chargé positivement (cytoplasme).
Colorant basique (cationique) --> lien électrostatique avec un groupe tissulaire chargé négativement (noyau).

Teinture (H.E) : combinaison d’Hématoxyline (espèce basique) et d’Eosine (espèce acide). ==> Noyau --> bleu/noir
==> Cytoplasme --> rose/orange

Composants basophiles = acides. Principe de neutralité (équilibre +/-).
Ainsi, un colorant basique (hématoxyline, hématéine, etc.) peut faire
apparaître au microscope des éléments riches en acides nucléiques, tels que les chromosomes, l’ADN ou l’ARN. Notre production A) Description Le microscope comprend trois systèmes optiques :

- Le condensateur : produit un faisceau de lumière qui produit l’objet étudié.
- L’objectif : système convergent constitué de plusieurs lentilles associées. Il est assimilable à une lentille mince de courte distance focale (de l’ordre du millimètre). Nous y trouvons précisé le grandissement 1 (exemple : x4). Il agrandi l’objet et projette l’image sur l’oculaire en donnant ainsi une image intermédiaire.
- L’oculaire : une lentille convergente de distance focale de l’ordre du centimètre et son grandissement G2 est de l’ordre de x10. L’image intermédiaire constitue l’objet pour l’oculaire. Il augment encore plus la taille de l’image et la projette sur la rétine de l’oeil de l’observateur. B) Utilisation L’objet observé est placé entre deux lames de verre posées sur la platine. Celle-ci est percée d’un trou permettant d’éclairer l’objet par le dessous à l’aide d’une lampe ou d’un miroir plan ou concave sphérique. La quantité de lumière est déterminée dans le choix de miroir et le réglage du diaphragme á l’iris. Le bloc comprenant l’objectif et l’oculaire peut se déplacer à l’aide du bouton de commande de la crémaillère. Il est également possible d’obtenir un déplacement très faible a l’aide du bouton de commande de la vise micrométrique. Pour observer convenablement une préparation microscopique nous devons donc :

- Assurer l’éclairage de l’objet
- Effectuer la mise au pointe à l’aide du bouton de commande de la crémaillère de la vise micrométrique.

Ces réglages étant effectués nous observons une image définitive renversée et plus grande que l’objet. Modélisation Attention: Pour mettre en évidence ses caractéristiques, le microscope sera modélisé en considérant l’objectif et l’oculaire comme des lentilles minces convergentes. Formation des images L’objectif donne de l’objet AB une image intermédiaire A1B1 renversée, proche de l’oculaire. Cette image constitue l’objet pour l’oculaire qui en donne une image définitive A’B’.
Plaçons-nous dans le cas où l’image définitive A’B’ se situe á l’infini (l’oeil n’accommode pas). L’image intermédiaire A1B1 doit alors se trouver dans le plan focal objet de l’oculaire. La construction de l’image est représentée ci dessous. Le cercle optique Si l’on déplace à partir de l’oculaire, un écran perpendiculairement à l’axe optique, on observe une tâche lumineuse dont le diamètre est minimum pour une position de l’écran très proche du foyer image de l’oculaire. Ce cercle de diamètre minimum par lequel passent tous les rayons émergents de l’oculaire est appelé cercle oculaire. Il correspond à l’image de la monture de l’objectif donné par l’oculaire.

C’est donc à ce niveau que l’observateur doit placer sa pupille, dont le diamètre est généralement supérieur au diamètre du cercle oculaire, afin de recevoir le maximum de lumière. Le grossissement Compte rendu du TP sur le microscope Pour approfondir notre développement sur le microscope, nous avons réalisé un TP de terminale spé physique sur le microscope, nous permettant de mieux comprendre comment fonctionne de cet appareil essentiel dans notre développement
du TPE.
Nous avons procédé à deux expériences qui nous ont permis de mettre en évidence
les différents mécanismes du microscope : - On a d’abord placé sur la platine un papier sur
lequel est dessinée une fourmi.
- On fait la mise au point l’avec l’objectif avec le
plus petit grandissement (G x 40).
- On enlève l’oculaire, qui sert à agrandir l’image
produite au plan focal de l’objectif. Cet objectif est
une loupe perfectionnée pour permettre une image à l’infini, pour que l’oeil n’ait pas à accommoder.
- On place un tube avec papier calque qui nous
permet de visualiser l’image intermédiaire 1. En procédant avec un microscope optique : 2. A plus grande échelle avec le banc d’optique : - On prend une lentille (L1) qui a pour distance focale f’1=12.5 cm (8 dioptries) et une lentille (L2) qui a pour distance focale f’2 = 33.3 cm (3 dioptries) et la distance entre les deux centre optique O1O2 = 60 cm.
- On place tout le matériel sur le banc : l’objet lumineux et les lentilles, puis on positionne un écran au niveau du plan focal de l’objet de (L2) et déplacer l’objet lumineux de sorte que l’image intermédiaire soit localisée sur l’écran.
- On retire alors l’écran et on regarde au travers de (L2) et on observe l’image grossie, renversée, sans devoir accommoder l’oeil.di Elles nous ont permit de :
- Mieux comprendre le fonctionnement de l’optique, mise en évidence de l’image intermédiaire formé grâce à (L1) et qui se situe sur le foyer objet de (L2).
- Déterminer la fonction de l’oculaire dans l’accommodation. Qu’est-ce ces manipulations nous montrent ? Le rôle d’un microscope est de permettre à l’oeil de voir l’image définitive d’un objet sous un diamètre apparent supérieur au diamètre apparent de vision directe de l’objet à l’oeil nu. Remarque : Afin de pouvoir connaître et comparer le grossissement de divers microscopes, on définit le grossissement standard en se référant à des conditions indépendantes de l’utilisateur. Le grossissement standard Le grossissement standard est défini dans les conditions suivantes:
- L’image observée est à l’infini; l’oeil n’accommode pas;
- La distance minimale de vision distincte est: dm=0.25 m
Déterminons le grossissement standard. Chaque élément du microscope
contribue à ce grossissement:
- L’objectif dans une image intermédiaire plus grande que l’objet. Le
grandissement 1 de l’objectif s’écrit, en valeur absolue :
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