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Separación y Purificación de Proteínas

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Pamela Calle

on 15 January 2014

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Transcript of Separación y Purificación de Proteínas

• Método de separación y caracterización de proteínas.
• Donde anticuerpos reacciona con las proteínas.
• Se prefiere el gel de agarosa debido a que tiene un tamaño de poro mayor que otros medios permitiendo el libre paso y separación de las proteínas.
• Pero igual es lo suficientemente estrecho como para impedir el paso de complejos antígeno-anticuerpo.


Este método permite la obtención de las proteínas de mayor tamaño primero y en secuencia.
En presencia de agentes desnaturalizantes, la proteína pierde su estructura nativa, Esto altera el plegamiento 3D de la proteína.
Separación y Purificación de Proteínas
Marco Teórico
Proteínas
Purificación y Separación de
Proteínas
Proceso de varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de la proteína o de la molécula de interés.
Pamela Calle, Nikole Eldredge, Priscila Merino
Mateo Ruano , Juan Báez y Vale Campoverde.

Objetivos
Identificar los métodos de separación y purificación de proteínas.
Analizar las aplicaciones de la separación y purificación de proteínas en la Biotecnología.
Comparar los métodos de separación y purificación de proteínas.
Las proteínas son moléculas compuestas por una o más cadenas de aminoácidos.
Las proteínas desempeñan la mayoría de funciones fisiológicas elementales. Están presentes en estructura, funcionamiento, transporte, defensa, señales y almacenamiento.
Proceso 1: Cromatografía por Intercambio Iónico.
Procesos de Purificación y Separación
El objetivo de este proceso es el estudio detallado de las características y propiedades de una proteína en específico.
Para que el proceso tenga éxito se debe contar con una muestra homogénea que solo contenga moléculas de un tipo.
Consiste en una matriz porosa con grupos cargados
La carga en las proteínas dependen de sus propiedades ácido- base de sus grupos -R
Cromatografía
La cromatografía es un método de separación de moléculas diferentes que se encuentran presentes en una misma muestra.
Se basa en la circulación de una fase móvil (arrastrar la muestra) a través de una fase estacionaria
Mecanismo de Acción
Los grupos cargados de la Matriz adsorben muestra de carga opuesta de las cargas de las Proteínas.
Así los grupos de carga negativa adsorben los iones de carga positiva y los grupos de carga positiva adsorben los iones de carga negativa generándose un intercambio iónico.
Cromatografía
de Filtración en Gel
Separación de moléculas en virtud de su tamaño.
La capacidad de separación reside en el gel cuya matriz consta en un gran número de esferas porosas microscópicas.
Mecanismo de Acción
Las moléculas de menor tamaño penetran hacia el interior de las esferas y no son extraídas en las columnas de gel.
Cuanto mayor es una molécula, menor capacidad tiene de acceder al interior de las moléculas.
Electroforesis
La electroforesis es un método de separación de moléculas por su movilidad sobre un campo magnético.
Depende de la velocidad con la que se mueve la molécula sobre el campo eléctrico
En el caso de las proteínas se puede identificar el peso molecular y detectar los cambios en los aminoácidos
Combinación de una Electroforesis en Geles de agarosa seguida de una Inmunodifusión.

Inmunoelectroforesis
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida
Poliacrilamida
Los geles de Poliacrilamida son transparentes e insolubles lo que los hace perfectos para visualizar la muestra a través de ellos.
La poliacrilamida es un compuesto que se utiliza como soporte en los geles. Es químicamente inerte y su preparación en geles es rápida y fácilmente reproducible.
Electroforesis en Gel de
Poliacrilamida
PAGE SDS
Separa a la proteína estrictamente por su tamaño molecular. Anula las cargas de la proteína y entrega carga Negativa.
La carga del SDS genera movilidad dependiente del peso molecular, por lo que mientras más peso molecular tenga la proteína, mayor será su movilidad.
Inmunoelectroforesis
Electroforesis
Isoelectroenfoque
Se basa en la carga de las proteínas y en el pH en el cual las proteínas no tienen movilidad en un campo eléctrico.
En este proceso las proteínas se encuentran en un pH estable, el
mismo que en la prueba se va incrementando desde el ánodo
hacia el cátodo.
Electroforesis
Isoelectroenfoque
Con los cambios de pH, las proteínas migran de acuerdo a su carga.
Los extremos del gel están sumergidos en recipientes con tampones de distinto pH, uno ácido y otro básico, los que van a producir la gradiente
Conclusiones
Las proteínas son polímeros de aminoácidos y se producen en las células del cuerpo, siendo fundamentales para muchos procesos vitales.
Al contar con una muestra homogénea la purificación y separación de proteínas se realiza con total exactitud, debido que solo se trabaja con una fase química.
Cromatografía al ser una técnica analítica además de determinar el número de sustancias en una mezcla, ayuda a ver el desarrollo que realiza la reacción entre los componentes de la misma.
Electroforesis mediante esta técnica de separación, se logra distinguir las moléculas según su movilidad, utilizando un campo eléctrico de una matriz porosa.
La Inmunoelectroforesis tiene lugar únicamente cuando una proteína reacciona con su antisuero específico, en condiciones bien determinadas.

Referencias
• Se realiza una aplicación puntual a la muestra.
• Por lo que distintas proteínas estarán distribuidas a lo largo del gel según el eje de migración.
• Acabada la electrolisis, se realiza un canal en el gel llamado “ trinchero".
• Se mantiene a temperatura ambiente (20-22°C) durante (24-48h).
• Si se encuentran en proporciones adecuadas producen complejos antígenos- anticuerpos insolubles que precipitan y aparecen en el gel como bandas elipsoidales.
• Una vez formadas las bandas de precipitación, el gel puede lavarse para eliminar las proteínas que no hayan inmunoprecipitado y, posteriormente teñirse.

Separación y Purifación por
Electroforesis
• Cultek. (2006). Soluciones electroforesis. Protocolo y técnicas.
Recuperado el 12 de Octubre del 2013: http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-Electroforesis-protocolos.pdf
• Morales, D., Esmeralda, M. (2006).
“Métodos Físico-Químicos en Biotecnología” Instituto de Biotecnología, Universidad Autónoma de México. Recuperado el 12 de Octubre del 2013 de: http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/plataformas_de_proteomica.pdf
• Angelfire.com (s.f.). Electroforesis. Recuperado el 12 de Octubre de 2013
desde http://www.angelfire.com/scifi/anarkimia/Biologia/tecnicas/electrofresis.htm

Detergentes
Detergentes No Iónicos

Detergentes Iónicos
Detergentes Anfóteros
Débiles desnaturalizantes y no alteran la carga de las proteínas a las que se unen
Carga catiónica que se utiliza en la separación de proteínas muy ácdas o muy básicas.
Debiles desnaturalizantes que son muy utilizados en las proteínas de membrana.
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