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Métodos clásicos para el estudio de ácidos nucleicos

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rodrigo gonzalez

on 12 April 2013

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MÉTODOS CLÁSICOS PARA ESTUDIO DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. Permite obtención y análisis de secuencias genéticas de agentes patógenos.
Permite detectar variaciones nucleotídicas, incorporación y eliminación de elementos génicos que implican características fenotípicas nuevas. Secuenciación Automática Construcción de librerías genómicas.
Construcción de librerías de cADN.
Estudios de expresión genética.
Identificación de genes asociados a patologias.
Ha hecho posible el estudio de genomas completos.
Ha hecho posible el Proyecto Genoma Humano. ADN Recombinante. La piedra angular de la Biología Molecular es el gen.
Para facilitar el estudio de un gen, este puede ser aislado y amplificado.
Para esto el gen puede ser insertado en una molécula de ADN ajeno que puede ser usado como vehículo o vector que puede ser replicado en células vivas. ADN RECOMBINANTE:
Ingeniería Genética. Utiliza los principios de apareamiento de bases para la identificación de mRNA específicos.
Permite hacer la correlación de las características morfológicas del tejido con la expresión de un mRNA particular en un mismo cuadro. Hibridación in Situ: RNA Permite detectar amplificación, deleción, translocación de una secuencia en particular y número de cromosomas.
Se puede realizar en tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina, extendidos de medula osea y cromosomas en metafase. Utiliza los principios de apareamiento de bases para la identificación de secuencias específicas de ADN directamente en una matriz de tejido.
Permite hacer la correlación de las características morfológicas del tejido con la situación de la secuencia de ADN en particular en un mismo cuadro. Southern Blot Southern Blot Obtención del ácido nucleico (ADN).
Corte con enzima de restricción.
Separación electroforética. Gel agarosa denaturante.
Traspaso a membrana de nylon o nitrocelulosa.
Hibridación con sonda radioactiva, biotinilada o fluorescente.
Revelado por autoradiografía. Etapas Técnica de hibridación de ADN.
Es capaz de detectar un fragmento de restricción específico entre una compleja mezcla de otras secuencias.
Tiene amplias aplicaciones como por ejemplo, detección de polimorfismos, mutaciones, deleciones e inserciones.
Es técnica de referencia. Southern Blot Northern Blot: Obtención del ácido nucleico (ARN).
Separación electroforética. Gel agarosa denaturante (formaldehido o glicoxal)
Traspaso a membrana de nylon o nitrocelulosa.
Hibridación con sonda radioactiva, biotinilada o fluorescente.
Revelado. Northern Blot Hibridación:
Clonación:
Secuenciación: Métodos clásicos de Biología Molecular ADN como ARN absorben luz ultravioleta con un pick de absorción a 260 nm.
Mediante el uso de la ley de Lambert-Beer se puede cuantificar la concentración usando la relación de su absorbancia a esa longitud de onda.
Una densidad óptica de 1.0 (DO) corresponde a 50 ug/ml de ADN de doble hebra y 38 ug/ml de ARN o ADN de hebra simple. Ácidos nucleicos: Cuantificación Para análisis de ADN a veces es necesario eliminar ARN co-purificado (RNAsas).
Para análisis de ARN generalmente se requiere eliminar restos de ADN utilizando DNAsa. Extracción: tratamientos posteriores. Muchos métodos comerciales utilizan esta modalidad.
Adsorción selectiva de los ácidos nucleicos a membrana de sílica gel en presencia de altas concentraciones de sales caotrópicas (compuesto que desorganiza la estructura terciaria de macromoléculas en especial proteínas). Extracción: Métodos basados en adsorción a sílica. Uso de Inhibidores de nucleasas.
Uso de agua y materiales pre-tratados con DEPC (Dietilpirocarbonato) que inhibe covalentemente a las RNAsas.
Uso de Beta-mercaptoetanol para RNA (agente disociante).
Eliminación de proteínas asociadas a los ácidos nucleicos (Proteinasa K). Extracción de Ácidos Nucleicos
Estabilización: QUICK AND DIRTY son los métodos de extracción mas sencillos:
calentar la muestra a 90ºC por 20 minutos, centrifugar y usar sobrenadante.
Digestión directa con Proteinasa K (PK) en un búfer adecuado. Inactivar PK 90ºC por 10 minutos
Su aplicación es limitada, acarrea varios inconvenientes (inactivación incompleta de PK, presencia de inhibidores, etc). Extracción de ADN El ARN es una molécula inestable, de rápida degradación.
Requiere de tejido fresco o sangre recién extraída.
Se debe estabilizar de inmediato.
Soluciones estabilizadoras (RNA later)
Nitrógeno líquido. En general el ADN es una molécula bastante estable.
Requiere transporte y conservación a 4ºC.
Algunos análisis requieren ínfimas cantidades de muestra (reacciones de amplificación).
Otros análisis requieren concentraciones de ADN elevadas en alta pureza y mínima fragmentación (Southern blot). Fase pre-analítica: Técnicas altamente sensibles y específicas.
Las aplicaciones son innumerables
Microbiología
Diagnóstico y Pronóstico de Cáncer
Diagnóstico de Enfermedades Metabólicas congénitas.
Identificación forense y paternidad.
Farmacogenómica MÉTODOS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR Secuenciación Automática PCR en Tiempo Real Detección de RNA de EBV en Enfermedad de Hodgkin. Discrimina entre casos de polisomia (A) y amplificación (B). Hibridación In Situ Fluorescente
FISH. Diagrammatic respresentation of an RFLP analysis for the presence of the sickle-cell locus. Genomic DNA is isolated and digested with the restriction enzyme MstII. One MstII site is lost at the sickle-cell locus. The DNA is then Southern blotted and analyzed with a b-globin-specific probe corresponding to sequences at the 5'-end of the gene. Individuals homozygous for the normal globin genes will exhibit a single hybridization band since both maternal and paternal genes are unaffected. Heterozygotes will exhibit the normal band and the larger sickle-cell gene band. Homozygous sickle-cell individuals will exhibit a single larger hybridization band. Southern Blot ADN: 4ºC estable por varios días, -20ºC por meses y -70ºC en forma indefinida.
RNA: conservar a -70ºC hasta su utilización. Conservación de los extractos Método también conocido como “Salting out”, utiliza sales de Acetato de Amonio o de Potasio. La remoción de proteínas y otros contaminantes puede ser insuficiente. Produce resultados variables. Purificación por precipitación salina diferencial: Forman parte de los “Sistemas de Restricción” de las bacterias.
Este sistema es un sistema de defensa de la bacteria frente a ADN extraños.
Fue descrito inicialmente en E coli en respuesta a fago Lamnda K1. Cuando 2 ADNs de distinto origen son combinados, el resultado es una molécula de ADN recombinante. En 1972 convergen 3 descubrimientos que permitirán el desarrollo de esta disciplina:
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
ADN LIGASA
ADN POLIMERASA. ADN RECOMBINANTE:
Ingeniería Genética. CROMOSOMA 11 Utiliza sonda Her2/Neu de ADN marcado con Texas Red.
Adicionalmente utiliza sonda control marcada con fluoresceína dirigida a la región centromérica del cromosoma 11. Hibridación In Situ Fluorescente
FISH. Extracción de Ácidos Nucleicos
Purificación: solubilidad en fases inmisibles (Extracción Orgánica): Para lograrlo se aprovechan las características fisico-químicas de la molécula a aislar. La fase inicial de todo análisis de ácidos nucleicos requiere la obtención de la molécula de ADN o ARN en estado puro, libre de otros constituyentes celulares. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS La sustitución de la citocina del codón 531 del gen que codifica para la sub-unidad beta de la RNA polimerasa se relaciona directamente con la resistencia a Rifampicina en Mycobacterium tuberculosis. (J Clin Microbiol. 1994 April; 32(4): 1095-1098) SUSTITUCIÓN DE UNA CITOCINA POR ADENINA EN CODON 531 DEL GEN RpbB DE Mycobacterium tuberculosis. Secuenciación Automática La presencia de una banda en 125 pares de bases indica la presencia de Mycobacterium tuberculosis complex en la muestra analizada. Este patógeno requiere 30 dias de incubación para su crecimiento por medios habituales (medio Lowenstein jensen) y el examen directo por técnica de Ziehl Neelsen alcanza solo 60% de sensibilidad. Reacción de polimerasa en cadena
PCR TERMOCICLADOR CONVENCIONAL PROTOCOLO DE AMPLIFICACIÓN Reacción de polimerasa en cadena PCR Control: en todos los casos se cargó la misma cantidad de ARN. Distintos niveles de expresión de Stromelysin-1 Distintas citoquinas en el medio de cultivo para astrocitos de rata (13+ 1 control) Stromelysin-1 Es una metaloproteinasa que degrada matriz extracelular. Se ha relacionado con artritis reumatoide y metastatis de cancer.
Cytokine-induced changes in the level of stromelysin-1 transcript determined by Northern blot in mouse astrocytes. Primary cultures were stimulated with cytokines. After 22 h total RNA was isolated and subjected to Northern blot analysis using stromelysin-1 cDNA probes. Equal gel load of RNA was evaluated with ethidium bromide staining showing rRNA (see the lower panel). Northern Blot: PRIMER CICLO DOS MOLECULAS RESULTANTES DEL PRIMER CICLO EXTENSIÓN ALINEAMIENTO DENATURACIÓN 60 ºC 72 ºC MOLECULA INICIAL 94 ºC Reacción de polimerasa en cadena PCR Búfer de Elución Liberación de ácidos nucleicos Liberación de ácidos nucleicos de la membrana de sílica. Unión de ácidos nucleicos a membrana de sílica Extracción: Métodos basados en adsorción a sílica. Búfer de lavado Muestras para análisis de ADN: Muestras para análisis de ARN: VECTORES DE CLONACIÓN. Los vectores de clonación son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados Los vectores se caracterizan por tener una replicación autonoma dentro de la celula y se encarga de conferir propiedades fenotipicas a la celula. BIBLIOTECA GENÓMICA Es una población de bacterias huésped, cada una de ellas lleva un ADN que fue insertado en un vector de clonación, de tal manera que la colección de clones representa todo el genoma del organismo fuente. Este término también representa la colección de todos las moléculas vector, cada una con un fragmento del ADN cromosómico del organismo, antes de la inserción de estas moléculas en las células huésped  Una biblioteca genómica es un conjunto de clones, cada uno de los cuales contiene un fragmento de un genoma de un organismo dado.
 Como no es posible secuenciar un genoma en una sola reacción de secuenciación se lo divide en fragmentos, los cuales se almacenan en clones bibliotecas genómicas. Fundamento y principios básicos.
Dot-blot y Slot-blot
Southern blot
Northern blot
Hibridación in situ Celular
Acelular Sanger
Automatización Técnica de hibridación usada clásicamente para el estudio de expresión genética, detección y cuantificación de mRNA.
Proporciona una forma de comparación relativa de mensajero presente en dos muestras en la misma membrana.
Su uso está confinado principalmente a laboratorios de investigación. Etapas Her2/Neu: Oncogén de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Locus 17q11.
Su amplificación se correlaciona con respuesta efectiva a tratamiento con Trastuzumab (Herceptin) en pacientes con cáncer de mama.
Por el contario, pacientes sin la amplificación, no responden al tratamiento. ENZIMAS DE RESTRICCION Una enzima de restricción (o endonucleasas de restricción) es aquella que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto Tipos de enzimas
de restriccion TIPO I
Enzima Bifuncional de 3 subunidades, R, M y S (2:2:1)


Sitio de Recon. bipartito, asimétrico secuencia = 5-7 pb


Rompe DNA a ~100-1000 bases de distancia del sitio de reconoc, al azar.


R y M pueden competir o ser exclusivos



Se requiere ATP para la restricción TIPO II

Endonucleasa y metilasa son proteínas separadas


Sitio de reconocimiento. Palíndrome corto de
4-8 pb, la misma sec para R y M


Rompe en el sitio de reconoc. Produce extremos romos o cohesivos, dentro del sitio de recon.


R y M actúan por separado


No se requiere ATP para la restricción TIPO III
Enzima Bifuncional de 2 subunidades MS y R


Sitio de Recon. secuencia asimétrico = 5-7 pb


Rompe 24-26 pb río abajo del sitio de reconoc. Corte escalonado 2-4 bases apart.


R y M ocurren simultáneamente y pueden competir.


Se requiere ATP para la restricción EXTREMOS ROMOS EXTREMOS COHESIVOS Las Enzimas de restricción catalizan la ruptura del enlace fosfodiester dentro de una secuencia palindrómica de la cadena de ADN provocando un quiebre en la doble hebra.
Este quiebre puede producir extremos cohesivos (Hind III) o extremos romos (SmaI). Enzimas de Restricción. Enzima dependiente de ATP que forma nuevamente el enlace fosfodiester entre un fosfato 5’ de un nucleótido y el grupo hidroxilo 3’ de otro nucleótido (Ligación). ADN Ligasa hibridación In Situ BIBLIOTECA GENÓMICA
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