Real Time PCR

PCR Genel Bilgi

Real Time PCR

PCR üç değişik sıcaklıkta çalışan basamakların bir döngü halinde tekrarlanması ile gerçekleştirilir. İlk basamak denatürasyondur ve 94oC’ye ısıtılan DNA’nın iki zincirinin birbirinden ayrılması söz konusudur. İkinci basamak birleşmedir (annealing). Sıcaklığın düşürülmesi ile primerler çoğaltılacak bölgenin uçlarında yer alan kendilerine özgül dizileri tanıyarak hidrojen bağları ile bağlanırlar. Primerlerin özgül olarak bağlanması için kullanılan sıcaklık genellikle 50-70oC arasındadır. Üçüncü basamak polimerizasyon ya da sentez aşamasıdır. Reaksiyon karışımı sıcaklığa dirençli DNA polimerazın çalıştığı optimum sıcaklık olan 72oC’ye getirildiğinde, primerlere bağlanan enzim molekülleri dizinin 3’ ucuna kalıp DNA’ya uygun nükleotitleri ekleyerek DNA sentezi yaparlar. Bu üç basamak bir döngüyü oluşturur ve her tekrarlanışta iki primer arasında kalan özgül DNA parçasının birer kopyası çıkartılarak başlangıçtaki DNA miktarı her döngüde geometrik olarak çoğaltılır. Çoğaltılan DNA parçalarının (amplikon) gösterilmesi için agaroz ya da poliakrilamit jel elektroforezi (PAGE) yapılır. Elektroforez ile boylarına göre ayrıştırılan DNA dizileri etidyum bromür gibi çift zincirli DNA boyaları ile boyanarak morötesi ışık altında görüntülenir.

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yönteminin Kary Mullis tarafından

1985 yılında tanımlanmasından sonra nükleik asit amplifikasyon

yöntemleri hızla tanı laboratuvarlarına girmiştir.

1993 Nobel Ödülü

Real-time PCR yöntemi, nükleik asit amplifikasyonu ile eş zamanlı

olarak artış gösteren floresan sinyalinin ölçülmesiyle, kantitatif sonuç alınabilen bir PCR yöntemidir. Sıcaklık döngüleri ve floresan okunması aynı cihaz içinde ve aynı tüp içinde gerçekleşmektedir. Böylece hedef bölge, elektroforeze gerek kalmadan kısa bir süre içinde saptanabilmektedir. Aynı cihaz içerisinde hem çoğaltma işleminin, hem de çoğaltılan ürünleri saptama işleminin yapılabilmesi, bu yöntemi çok pratik bir yöntem haline getirmiştir. Ayrıca tüpler açılmadan test tamamlandığı için kontaminasyon riski de azalmaktadır. Real-time PCR’da amplifikasyon sonrasında elde edilen ürün varlığının saptanması çeşitli şekillerde yapılabilir. Bunlardan birincisi özgül olmayan bir yöntem olan çift zincirli DNA boyalarının kullanılmasıdır. Bu amaçla en sık kullanılan boya SYBR Green I’dir. Primerlerin bağlanmasını takiben gerçekleştirilen polimerizasyon aşamasında hedef DNA’nın çift sarmal hale gelmesiyle DNA’ya bağlanan boya miktarı artar ve buna bağlı olarak yayılan floresans miktarında artış gözlenir. Elde edilen floresansın istenen hedef bölgenin amplifikasyonuyla mı gerçekleştiği, yoksa non-spesifik bir ürün mü olduğunu anlayabilmek için “melting curve” (erime eğrisi) analizi yapılır. Çoğaltılan hedefin özgül olarak saptanması amacıyla işaretli problar kullanılır. Prob formatları arasında en sıklıkla FRET (Fluorescens Resonance Energy Transfer), Taqman ve “Molecular Beacons” yer almaktadır.

Real Time PCR

Avantajlar

Konvansiyonel PCR’ın avantajları:

1- Oldukça duyarlıdır.

2- Ucuzdur.

3- Protokol standardize edildikten sonra uygulanması kolaydır.

4- Duyarlık ve özgüllüğü artırmak için “nested PCR” ya da hot-start PCR”, RNA çoğaltmak için “rt-PCR”, çok sayıda mikroorganizmayı aynı tüpte saptamak için “multipleks PCR”, genel enfeksiyon varlığını saptamak için “broad-range PCR” gibi modifikasyonlar yapmak mümkündür.

Dezavantajlar

Konvansiyonel PCR’ın dezavantajları:

1- Kontaminasyon riski yüksektir.

2- Emek yoğundur.

3- Zaman alıcıdır.

Real-time PCR yöntemi çeşitli amaçlarla nükleik asitlerin kalitatif veya kantitatif olarak saptanabilmesi amacıyla kullanılabilmektedir.

Real-time PCR yöntemini, daha önceden geliştirilmiş olan standart PCR yönteminden ayıran iki önemli özellik vardır:

• Birincisi, real-time-PCR yönteminde termal döngü cihazıyla birleştirilmiş bir optik okuma sisteminin kullanılmasıdır.
• İkincisi ise, PCR işlemi sırasında amplifikasyonu bilgisayar ekranına yansıtacak bir probun veya probların bulunması gereğidir.

Bu nedenle özellikle uygun prob seçimi, real-time PCR işleminin verimliliğini etkileyen en önemli basamaklardan biridir.

Probun işlevi, cihaz içerisinde gerçekleştirilmiş olan çoğaltma işleminin, gözle görülür hale getirilmesidir. Prob kullanılmadan da, PCR tüpü içerisinde uygun primerlerin, dNTP’lerin ve enzimin kullanımıyla PCR işlemi gerçekleşecektir. Ancak prob kullanılmadan sonucun real-time PCR cihazının bilgisayarında görüntülenmesi mümkün olmayacaktır.

Problar, florofor denen ve belirli dalga boyundaki ışıkla uyarıldığında floresan ışıma yayabilme özelliğine sahip sentetik oligonükleotidlerdir. Genel olarak bakıldığında prob dizileri, PCR tüpü içerisinde çoğaltma işlemi gerçekleşirken, çoğaltılmış olan hedef DNA zincirlerine bağlanarak floresan ışıma oluşmasına neden olurlar. Bu işlemin gerçekleşebilmesi için problar, hedef DNA’nın belirli bir dizisine komplementer olacak şekilde dizayn edilmelidirler.

Prob, tek zincirli hedef DNA üzerinde komplementer olduğu bölgeye bağlandıktan sonra, real-time PCR cihazının ışık kaynağı, PCR tüpü içine uyarıcı kısa dalga boylu ışık gönderir. Kısa dalga boylu ışığın absorpsiyonu sonrasında, uzun dalga boylu ışık salınımı oluşur. Böylece gerçekleşen floresan ışıma, cihaz tarafından

algılanır. PCR tüpü içerisinde ne kadar çok hedef DNA varsa o kadar çok prob bağlanacak ve floresan ışıma miktarı da o derecede fazla olacaktır.

DNA’ya Özgül Olmadan Bağlanan Boyalarla Jenerik Saptama

Bu yöntemde, çift zincirli DNA’ya özgül olmadan bağlanan özel boyalar prob görevi görürler. Bu amaçla en sık kullanılan boya molekülleri “SYBR Green I” ve “SYBR Gold”dur. Bu boyaların çift zincirli DNA arasına girerek bağlanması sonucunda 20-100 katlık bir floresan ışıma artışı olur ve bu ışıma real-time PCR cihazı tarafından algılanır. Primerlerin bağlanmasını takiben gerçekleştirilen uzama aşamasında hedef DNA’nın çift sarmal hale gelmesiyle DNA’ya bağlanan “SYBR green” miktarı artar ve buna bağlı olarak yayılan floresan miktarında artış gözlenir. “SYBR green”, yalnızca çift zincirli DNA’ya bağlandığında floresan veren bir boyadır. Ancak floresan artışı her zaman özgül amplifikasyonu göstermeyebilir. Çünkü ortamda hedef DNA bulunmadığı durumlarda “SYBR green”, primerlerin kendi aralarında gerçekleşebilecek bağlanmalar (primer dimerleri) sonucunda bu yapılara katılarak floresan oluşumuna neden olabilmektedir. Böyle durumlarda elde edilen floresan ışımanın istenen hedef bölgenin amplifikasyonuyla mı gerçekleştiği, yoksa primer dimer oluşumu ile ortaya çıkmış özgül olmayan bir ürün mü olduğunu anlayabilmek için “melting curve” (erime eğrisi) analizi yapılır. Her çift sarmal DNA kendine özgü “melting temperature, Tm” (çift sarmal DNA’nın %50’sinin tek sarmal hale geçmesi için gerekli sıcaklık) değerine sahiptir.

PCR amplifikasyonu sonrasında sıcaklık yavaş yavaş yükseltilerek, belirli aralıklarla tüpteki floresan miktarı kaydedilir. Çift sarmal DNA zincirleri birbirlerinden ayrılmaya başlayınca “SYBR green” boyası serbest kalır ve floresan miktarı azalmaya başlar. Erime eğrisinden yararlanılarak Tm derecesi hesaplanır. Klinik örneğe ait Tm derecesi, aynı koşullarda işleme alınan pozitif kontrolün Tm derecesiyle karşılaştırılarak PCR sonucu elde edilen ürünün özgül ürün olup olmadığına karar verilir. Tm dereceleri aynı ise, aranan hedef bölgenin amplifikasyonu gerçekleştirilmiş demektir. Farklı Tm dereceleri saptanması durumunda, elde edilen amplifikasyonun özgül olmayan bir ürüne ait olduğu sonucuna varılır.

Real-time PCR işlemi ile çoğaltılmış olan hedef dizilerin görüntülenebilmesi amacıyla kullanılan çeşitli problar mevcuttur. Buradaki temel amaç, çoğaltılmış olan PCR ürünleriyle, kullanılan probun etkileşime girmesinin sağlanmasıdır. Bunun sonucunda hedef DNA’ya floresan veren boyaların bağlanmasıyla DNA kantitasyonu mümkün olabilmektedir.

Real-time PCR yönteminde floresan kimyası, iki sınıf altında incelenebilir:

Jenerik (genel) yöntemler ve zincire özgül yöntemler. Jenerik yöntemlerde DNA’ya özgül olmadan bağlanan problar kullanılır. Bir başka deyişle bu yöntemde kullanılan problar PCR tüpü içerisindeki her çift zincirli DNA’ya bağlanarak floresan oluşmasına neden olurlar.

Zincire özgül yöntemlerde kullanılan problar ise, primer bağlanma bölgeleri arasındaki hedef DNA’nın komplementer bir bölgesine bağlanarak floresan ışımaya neden olurlar. Bu yöntemlerin avantajı, primer-dimer bağlanması gibi özgül olmayan çoğaltma ürünlerinin floresan ışımayla sonuçlanmamasıdır. Bu nedenle özgüllükleri daha yüksektir ve daha iyi sinyal oluşumu sağlarlar.

DNA’ya Özgül Olarak Bağlanan Problarla Saptama

Bu tür yöntemlerde prob, çoğaltılmış olan ürünün tamamına değil, ürün

içindeki özgül bir bölgeye bağlanır. Bir başka deyişle, floresan ışıma oluşması

aslında tam olarak hedef bölgenin değil, hedef bölge içindeki proba

komplementer dizinin varlığını göstermektedir. Böylece hedef bölgenin varlığı

dolaylı yoldan gösterilmiş olmaktadır. Bu yöntemde probların verimliliği çok

önemlidir. Kullanılan problar, çoğaltma işleminin başlangıç aşamasındaki az

sayıdaki hedef bölge varlığını da saptayabilmelidir. Farklı şekilde işlev gören

değişik problar mevcuttur.

Özgül problar kullanılarak real-time PCR ile amplifikasyonun saptanması

(FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer): Özgül problardan biri 3’

ucundan floresan boya ile işaretli (donör boya), diğeri 5’ ucundan alıcı boya

(acceptor dye) ile işaretlidir. Bu tür problara dual hibridizasyon probları adı

verilir ve uzunlukları 30 nükleotide kadar olabilir. Lineer hibridizasyon probları kullanılarak real-time PCR ile amplifikasyonun saptanması, direkt hibridizasyon esasına dayanır. Bağlanma sonrasında ikinci probun 5’ ucundan sentez olmaması için bu uca bir fosfat bağlanmıştır. Problar hedef bölge üzerinde birbirine yakın yere (1-5 nükleotid uzaklıkta) bağlanır ve işaretli uçlar yanyana gelmiş olur. İki boyanın yanyana gelmesiyle açığa çıkan enerji, ikinci prob üzerindeki alıcı boyayı etkileyerek floresan oluşumuna neden olur. Oluşan floresan miktarı, ortamdaki hibridizasyonun derecesine (PCR ile oluşan ürün miktarına) bağlı olarak artar.

Her PCR döngüsünün düşük sıcaklık basamaklarında prob hedef DNA’ya bağlanarak ışıma sağlar, yüksek sıcaklık basamaklarında hedeften ayrılır. Her döngüde, probların bağlanabileceği hedef DNA miktarı arttığı için, sinyal miktarı

da artar.

“Molecular beacon” ve diğer konformasyonel problar kullanılarak real-time PCR ile amplifikasyonun saptanması: Konformasyonel problarla PCR ürününün saptanması, DNA’ya bağlandıktan sonra meydana gelen yapısal değişiklik sonucunda ışıma oluşması esasına dayanır. “Molecular beacon” yapıları, TaqMan problarından geliştirilmiştir. Bu nedenle kimyasal yapısı, 5’ ve 3’ uçlarında raportör ve baskılayıcı florokrom bulunması nedeniyle 5’ nükleaz aktivitesinde kullanılan problara benzerdir. Ancak saptama aşaması, probun kırılmasıyla ışımanın oluşması esasına dayanmaz. Bu yapılar 5’ ve 3’ uçları bir firketenin iki ucunu oluşturacak şekilde, bükülmüş bir yapıda dizayn edilmişlerdir. Raportör ve baskılayıcı moleküllerin komşuluğunda birbirine komplementer diziler vardır.

“Molecular beacon” yapısının komplementer olduğu hedef DNA’ya tam olarak bağlanabilmesi için, bu yapının doğrusal olarak açılması ve bu şekilde bağlanması gereklidir. Bu açılarak bağlanma sonucunda iki florokrom birbirinden uzaklaşır ve baskılayıcı etki ortadan kaltığı için ışıma oluşur.

TaqMan probları kullanılarak real-time PCR ile amplifikasyonun saptanması (5’ ekzonükleaz aktivitesi): Bu sistemde 5’ ve 3’ uçlarından florokrom maddelerle işaretli TaqMan probları kullanılır (“dual labelled probe”). Probun 5’ ucunda raportör florokrom, 3’ ucunda ise baskılayıcı florokrom bulunur. Prob, tek sarmal

hale getirilen hedef bölge üzerinde, primerlerin bağlanma bölgesinin arasında kalan yere bağlanır. Prob ile hedef bölge arasındaki hibridizasyon devam ettiği sürece raportör florokrom maddenin sinyal oluşturması, 3’ ucundaki baskılayıcı florokrom madde tarafından engellenir. Primerlerin hedef nükleik asite bağlanmasını takiben başlatılan primer uzaması probun bağlandığı noktaya geldiğinde, sentezin devam edebilmesi için TaqDNA polimeraz enzimi 5’-3’

ekzonükleaz aktivitesini kullanarak probu 5’ ucundan itibaren yıkmaya başlar.

Böylece raportör florokrom serbest hale geçer ve sinyal oluşturur. Her döngüde üretilen ürün arttıkça, floresan miktarında artma gözlenir. Bu yöntemde dikkat edilmesi gereken nokta, ışımanın probun DNA’ya bağlanmasıyla oluşmadığı, probun kırılarak ayrılmasını sağlayan 5’-3’ ekzonükleaz aktivitesi ile oluştuğudur.

Bu nedenle bu tür problara hidroliz probları adı verilir.

Gerek hibridizasyon probları kullanıldığında, gerekse hidroliz probları kullanıldığında, her PCR döngüsünde oluşan floresan ışıma miktarı artar. Ancak floresan sinyali oluşumu, hibridizasyon problarında hedef DNA’ya bağlanma sonucunda oluşurken, hidroliz problarında hedef DNA’dan ayrılma sonucunda oluşur. Hibridizasyon probları özellikle mutasyonların saptanmasına yönelik erime

eğrisi analizi için uygunken, hidroliz probları erime eğrisi analizinde kullanılamazlar.

1. Bernard PS, Reiser A, Pritham GH. Mutation Detection by Fluorescent Hybridization Probe Melting Curves. In Meuer S, Wittwer C, Nakagawara K (eds.) Rapid Cycle Real-Time PCR: Methods and Applications, p. 11-19. 2001. Springer Verlag Berlin Heidelberg Newyork, Germany.

2. Burkardt HJ. Standardization and quality control of PCR analyses. Clin Chem Lab Med 2000; 38(2):87-91.

3. Chudy M, Hewlett I, Saldanha J et al. Technical considerations for the performance of Nucleic acid Amplification Technology (NAT). Biologicals 2003; 31:153-159.

4. Didenko VV. DNA probes using fluorescence resonance energy

transfer (FRET): design and applications. Biotechniques. 2001; 31:1106-1121.

5. Edwards KJ, Logan JMJ. Mutation Detection by Real-Time PCR. In Edwards K, Logan J, Saunders N (eds.) Real-Time PCR, An Essential Guide, p. 185-210. 2004. Horizon Bioscience, Norfolk, U.K.

6. Landt O. Selection of Hybridization Probes for Real-Time Quantification and Genetic Analysis. In Meuer S, Wittwer C, Nakagawara K (eds.) Rapid Cycle Real-Time PCR: Methods and Applications, p. 35-41. 2001. Springer Verlag Berlin Heidelberg Newyork, Germany

7. Saunders NA. An Introduction to Real-Time PCR. In Edwards K,Logan J, Saunders N (eds.) Real-Time PCR, An Essential Guide, p. 1-11. 2004. Horizon Bioscience, Norfolk, U.K.