DNA Parmakizi ve Adli Analizler

DNA Parmakizi

Tek baz değişikliği içeren lokuslarda gözlenen toplam allel sayısı az olduğundan bireyleri ayrım güçleri sınırlıdır. Bu tip polimorfizm daha çok kalıtsal hastalıkların tanısında önem taımaktadır.

DNA parçalarının elektroforez sonunda oluşturduğu bantlardır ve bu bantlar protein, DNA veya RNA olabilir.

VNTR lokuslarındaki polimorfizm, bireyler arasında belli bir baz diziliminin ardarda tekrarlanma sayılarındaki varyasyonlardan kaynaklanmaktadır. Farklı VNTR lokuslarında, tekrarlanan baz diziliminin uzunluğu değişmektedir. Bu lokuslarda tekrarlanan dizilim 2-30 veya daha fazla sayıda baz çifti içermektedir. Bu lokuslar, çok sayıda farklı uzunlukta allele sahip olduklarından bireyleri ayrım güçleri yüksektir. Adli örneklerin analizinde yaygın olarak VNTR lokusları çalışılmaktadır.

Elde edilen bantlar bireye özgüdür ve bireyin genetik yapısının tanımlanmasında ve akrabalarının tespitinin gerektiği durumlarda kullanılabilir.

Parmakizi test yöntemleri

Her canlının DNA yapısı bireye özgüdür.

• İlk kez Alec Jeffreys tarafından 1985’de düşünüldü (miyoglobin genleri ile çalışmaktaydı).

1. Tek lokus DNA parmakizi

Çeşitlilik spesifik bir prob veya PCR primerleri kullanılarak tek bir lokusda belirlenir.Özellikle DNA kırık veya hasarlı elde edilmişse bu yöntem avantajlıdır.

2.Multilokus DNA parmakizi

Birden fazla lokusdaki çeşitlilik aynı anda belirlenir. Burada tek lokusa özgü problar, birden fazla benzer dizi çeşitliliklerini belirleyebilir. Burada hiç bilinmeyen DNA dizileri üzerinden bir fenotip oluşturulmaktadır. Tek lokusa göre daha bilgi vericidir.

Günümüze kadar adli amaçlarla rutinde kullanılan DNA teknolojisinin gelişimini temel olarak dört kısımda incelemek mümkündür:

• Çok-lokus (multi-locus) problarının kullanıldığı DNA parmakizi yöntemi (DNA fingerprinting),

• Tek-lokus (single-locus) problarının kullanıldığı DNA profillemesi (DNA profiling),

• Çoğaltılmış parça uzunluk polimorfizminin (Amplified fragment length polymorphism,- AMPFLP) analizi, • Kısa ardarda tekrar eden dizilimlerin (short tandem repeats,-STRs) analizi.

DNA profillemesi

• İnsanların genomları (tek-yumurta ikizleri hariç) birbirinden farklıdır. Bu durum genomların “belirleyici” olarak kullanımı sağlamaktadır.

Çok-lokuslu bir prob kullanılarak, genomdaki çeşitli minisatellit lokuslarının aynı anda incelendiği DNA parmakizi yönteminin adli serolojideki ilk uygulamaları 1986’larda başlamıştır. Bu yöntem ile bireye spesifik DNA band paterni elde edilmektedir. Populasyondan rastgele seçilen iki kişinin (tek yumurta ikizleri hariç) aynı DNA band paternine sahip olma olasılığının teorik olarak 1/30 milyar olduğu bildirilmiştir. Ancak yöntemin kompleks ve zaman alıcı olması, sonuçta oluşan 30’dan fazla DNA bandının değerlendirilmesindeki güçlükler nedeniyle çok-lokuslu problar rutinde kısa bir süre için kullanılmış ve yerini tek-lokus problarının kullanıldığı DNA profilleme yöntemi almıştır.

Satelitler

Çok yüksek seviyede tekrarlı kısımlardır, 100 milyon baza kadar çıkabilir. Kromozomların sentromer ve telomere yakın olan heterokromatin bölgelerinde yer alır. Özellikle Y kromozomunda boldurlar.

Minisatellitler

DNA Parmakizi ve Adli Analizler

Daha orta seviyede tekrarlı olan tandem dizilerdir (9- 100 bç, genellikle 15 bç), genellikle ortalama 0.5- 30 kb’lik arraylerde bulunurlar. Omurgalıların, mantarların ve bitkilerin genomunda ökromatin bölgelerinde bulunurlar.

Mikrosatellitler

Orta seviyede tekrarlıdır, kısa tekrarlardır (2-6 bç) . Omurgalı, böcek ve bitki genomunda vardır. İnsan genomunda ökromatin bölgelerde en az 30.000 mikrosatelit lokusu olduğu tahmin ediliyor. Kopya sayıları populasyonlar arasında farklılık gösterir, ortalama 10-100’dür.

VNTR’lar

RFLP ANALİZİ

Her DNA zincirinin organizmanın gelişmesiyle ilgili genetik bilgiyi içeren parçaları (exonlar) ve görünüşte hiçbir genetik bilgiyi taşımayan parçaları (intronlar) vardır. Her ne kadar intronlar gereksiz gibi görünse de DNA’nın 3-boyutlu konformasyonunun oluşumunu ve henüz keşfedilmemiş özellikleri kontrol etmektedir. Bu gen olmayan DNA bölgelerinin tekrarlayan baz çifti dizilerini içerdikleri bulunmuştur. Bu diziler, Variable Number Tandem Repeats (VNTRs) değişken sayıda sıralı tekrarlar olarak adlandırılır ve 20’den 100’e kadar baz çifti içerebilirler.

DNA’nın restriksiyon enzimleri kullanıralarak bu enzimlere spesifik olan bölgelerden kesilmesi esasına dayanır. Kesim işlemi sonucunda uzun DNA molekülü restriksiyon fragmanları olarak adlandırılan çok sayıda DNA parçacıklarına ayrılır. Ekstrakte edilen DNA’nın tek bir enzimle dahi sindirilmesinden sonra farklı uzunluk ve dizide yüz binlerce kesilmiş DNA fragmanı oluşur. Yöntemin esası restriksiyon enzimi ile kesilerek bir çok fragmana ayrılan DNA’nın, fragmanlarının denatüre edilmesi ve naylon membrana aktarılması sonrasında spesifik problar ile hibridizasyonuna dayanır. Problar DNA dizisine spesifik olarak hazırlanmış, radyoaktif izotoplarla işaretlenmiş, tek zincirli, kısa DNA parçacıklarıdır. Hibridizasyon uygun hibridizasyon solüsyonları içeren banyolarda gerçekleştirildikten sonra nonspesifik bağlanmalar yıkanarak uzaklaştırılır ve oluşan bandlar röntgende otoradyografik olarak gösterilir. Bu şekilde elde edilen otoradyogramlar parmak izi gibi bireye özgü olduğundan DNA parmak izi olarak adlandırılmaktadır. Yöntemin uzun sürmesi, zahmetli olması, radyoaktif madde ile temasa neden olması ve fazla miktarda DNA’ya ihtiyaç duyulması gibi sınırlayıcı yönleri vardır. Sayılan bu nedenlerden dolayı günümüzde yerini PCR tekniğine dayalı STR analizlerine bırakmıştır.

VNTR’ları ayırt etmek için en sık kullanılan adli tıp metodu Southern Hibridizasyonudur. Eğer bir VNTR’ın iki yanından DNA, bir restriksiyon endonükleazla kesilirse, sonuç DNA fragmentlerin boyu değişiklik gösterebilir, RFLP yani restriksiyon fragment boy polimorfizmi ile sonuçlanır.

Verilen bir insanın VNTR’ları onun anne-babası tarafından verilen genetik bilgiden gelmektedir, kişi annesinden veya babasından veya her ikisinin kombinasyonundan kalıtılan VNTR’lara sahip olabilir, fakat asla annesinde veya babasında olmayan bir VNTR’a sahip olamaz.

Bir VNTR lokusunun Southern Hibridizasyonu ile analizi çoğunlukla her ebeveynden kalıtılan bir bantı içeren iki-bant kalıbı şeklinde sonuçlanır. Eğer iki ebeveyninde bant boyutları aynı veya neredeyse aynıysa tek bir bant kalıbı oluşabilir.

PCR ANALİZİ

VNTR kalıpları genetik olarak kalıtıldığı için, verilen bir insanın VNTR kalıbı daha fazla veya daha az özgül olabilir. Bir insanın VNTR kalıbının analiz etmek için daha çok VNTR probları kullanılırsa, daha özel ve bireyselleştirilmiş pattern veya DNA parmak izi elde edilir.

STR lokuslarının analizi genel olarak beş temel basamaktan oluşmaktadır:

1) Adli örneklerden DNA’nın ekstraksiyon ve izolasyonu,

2) çalışılacak STR lokuslarının PZR ile çoaltılması,

3) çoğaltılan STR lokus allellerinin elektroforez ile ayrımı,

4) allellerin görünür hale getirilmesi,

5) sonuçların değerlendirilmesi

PCR hücre çekirdeği içerisinde cereyan eden DNA replikasyonunun bir

analoğudur. DNA’nın hedeflenen bir bölgesinin eksponansiyel olarak çoğaltılması amacına hizmet eder. Yöntemin esası çoğaltılması istenen hedef DNA bölgesinin hemen yakınındaki dizilere komplementer olarak sentez edilen oligonükleotidlerin, denatüre edilen DNA zincirlerinin farklı uçlarına bağlanması ve bu bağlanma noktalarından itibaren DNA polimeraz enzimi yardımı ile DNA’nın 3' ucu yönünde komplementerinin sentez edilmesine dayanır. Bu yöntem ile başlangıçta var olan DNA’daki hedef bölgelerin milyonlarca kopyasının elde edilmesi işlemine amplifikasyon adı verilir. PCR analizi üç aşamada özetlenebilir:

-DNA zincir ayrılması (Denatürasyon)

DNA çift zincirli olup bunun tek zincirli hale getirilmesine, yani iki zincirin arasındaki hidrojen bağlarının koparılarak birbirinden ayrılması işlemine denatürasyon adı verilir.

-Primer bağlanması (Annealing)

Tek zincir haline gelen herbir DNA’nın çoğaltılması istenen bölümüne bitişik nükleotidlere komplementer olan bir oligonükleotid grubu (primer olarak adlandırılır), yaklaşık 90-95 C° derecelik ısının düşürülmesi ile komplementeri olan dizileri tanır ve onlara bağlanır.

-Zincir uzaması (Ekstansiyon)

Ortama eklenmiş olan DNA polimeraz enziminin primerlerden itibaren hedef diziye komplementer nükleotidleri eklemesi ile zincirin uzamasıdır. Bunun için DNA polimeraz enziminin optimum aktivite gösterebileceği bir ısıya (68-72 C°) ihtiyaç vardır. Bu şekilde hedef DNA bölgesi replike olmuş olur. Bu yöntemin avantajları eser miktardaki biyolojik örneklerden dahi DNA tiplemesine olanak vermesidir. Yöntemin hızlı ve kolay olması ise bir diğer avantajıdır.

STR Lokusları

STR lokusları, 2-7 baz çifti uzunluğunda belli bir baz dizilimine sahip, baş-kuyruk şeklinde ardarda tekrarlanan ünitelerden oluşmaktadır. STR’lerin tekrarlanan ünitesindeki baz sayısı minisatellitlerden daha az olduğu için bu lokuslara mikrosatellitler de denilmektedir. Bu bölgelerin insan genomu boyunca dağılmış olup, her 6-10 kb’de bir görüldüğü saptanmıştır. Adli amaçlı çalışmalarda, bu lokusların bireyden bireye tekrarlanan ünite sayılarındaki varyasyonlardan yararlanılmaktadır.

• DNA parmakizlerinin tanımlanması
• Her şahsın DNA'sını neyin özgün kıldığı
• DNA profillerinin karşılaştırılması
• DNA uyumunun olması için nelerin gerektiği
• Delil olarak DNA'nın önemi ve yararlanılabilirliği
• Mitokondriyal DNA'nın akrabalık ilişkilerinin belirlenmesinde kullanılabilirliği, nasıl kullanılabileceği
• Önemli bitki ürünlerinin kaynağının belirlenmesi, yaban hayatın korunmasında yasaların uygulanmasında yardımcı olması,biyolojik araştırmalar için DNA analizleri

STR lokusları tekrarlanan ünitenin sayısından ve baz çifti olarak uzunluğundan kaynaklanan varyasyonların yanısıra bazen homojen tekrar ünitelerinde nokta mutasyonları veya insersiyon/delesyonlardan kaynaklanan baz dizilim farklılıkları da göstermektedir. Bu açıdan STR’leri üç grupta incelemek mümkündür:

1. Basit STR’ler: Baz sayısı ve baz dizilim sırası aynı olan tekrar üniteleri içerirler. Ör: HumCD4 (Human recognation/surface antigene gene), HumFES/FPS (Human c-fes/fpsproto-oncogene), HumTHO1 (Human tyrosine hydroxylase gene), HumF13A01 (Human coagulation factor XIII a subunit gene), HumF13B (Human coagulation factor XIII b subunit gene).

2. Bileşik STR’ler: Baz dizilim sırası birbirinden farklı olan iki veya daha fazla sayıda tekrar ünitelerinden oluşurlar. Ör: HumvWFA31 (Human von Willebrand factor gene),

3. Kompleks STR’ler: Baz dizilimi ve baz sayısı farklı olan birkaç tekrar bloğu içerirler. Ör: D21S11.

Dezavantajlar

a) Bu markırlar diğer biyolojik materyallerden ziyade taze kan örneklerinde ve kan lekelerinde etkin olarak incelenebilmektedirler.

b) Varyasyon düzeylerinin sınırlı olması nedeniyle tek başlarına biyolojik tanımlayıcı olarak kullanılamamaktadırlar. Bireyin baba olma olasılığını söyleyebilmek için veya mahkemelere delil teşkil eden biyolojik materyalin zanlıya/mağdura ait olup olamayacağını söyleyebilmek için tüm antijenik ve protein markırların çalışılması gerekmektedir.

c) Antijenik ve protein markırlar, biyolojik sıvılara ait lekelerde çevre koşullarına bağlı olarak kısa sürede yapısal değişikliğe uğramaktadırlar.

d) Bireye yapılan birkaç kan transfüzyonundan sonra nakledilen kana bağlı olarak değişiklik gösterebilmektedirler.

e) Markırların incelenmelerinde kullanılan yöntemler ise çok küçük miktarlardaki materyallerden sonuç alınabilecek kadar hassas değildir.

MONOPLEX ve MULTİPLEX PCR ANALİZİ

Bitkilerin DNA ile Kimliklendirilmesi

Başlangıçta DNA üzerindeki tek bir bölgeyi hedef alan ve çoğaltan PCR reaksiyonları yapılırken gelişen teknoloji ile çok sayıda DNA bölgesinin bir arada çoğaltılabilmesi mümkün olmuştur. Bu sayede tek reaksiyon ile çok kısa sürede sonuç

alınabilmektedir. İlk geliştirilen multipleks PCR kitleri üç lokusu bir arada amplifiye eden üçlü primer karışımlarından ibaret iken daha sonra 5, 8, 10, 13 ve son olarak 16

lokusu bir arada amplifiye eden kitler geliştirilmiştir. Multiplex PCR sistemleri çok iyi optimize edilmelidirler. Çünkü her STR lokusunun farklı primer içeriği, dolayısıyla da farklı primer bağlanma ısısı vardır. Yine farklı lokusların değişik alelleri yakın baz uzunlukta olabilmekte ve jel elektroforezi sırasında birbiri üzerine çakışabilmektedirler. Kapiler elektroforez ile değişik renk boyalar kullanılarak bu

durum sorun olmaktan çıkarılmıştır.

Y KROMOZOM ANALİZİ

Bitki türlerinin çeşitliliğinin belirlenmesi, genetik araştırmalar ve yetiştiricilik için önemli olmaktadır.

• Genetik haritalamadan önce fenotipe dayalı markırlar kullanılıyordu.

• Ekmeklik buğday (Triticum aestivum) dünya nüfusu için en önemli besin kaynaklarından biridir.

• Bu kadar çok ekonomik önemi olan buğdayın en zayıf özelliği ise kuraklığa dirençliliğinin az olmasıdır.

Y kromozomu sadece erkek ebeveyn tarafından kalıtıldığından dolayı aynı soydan gelen tüm erkeklerde yeni bir mutasyon olasılığı dışında bir çok jenerasyon boyunca aynı haplotip görülecektir. Özellikle baba adayının bulunamadığı ya da baba adayının biyolojik materyalinden DNA elde edilemediği durumlarda, çocuk erkek ise baba adayının soy ağacında yer alan dede, amca, kuzen vs. gibi herhangi bir erkeğin Y-STR sonuçları olayın aydınlatılmasında kullanılır. Cinsel suçlar ise YSTR’nin kullanımının en sık olduğu alandır. Olgularda örnekler iyi koşullarda ve usulüne uygun toplansa bile sıklıkla faile ait DNA’yı içeren örnekler mağdurun DNA’sı ile karışmış halde bulunmaktadır. Böyle miks örneklere genellikle mağdurun vajinasından alınan sürüntüde ve iç çamaşırlarında rastlanmaktadır. Y kromozom analizini en sık, miks örneklerde, çok sayıda semen donörü varlığında, kardeşlik tayininde, çocuk erkek ise babalık tayininde, sadece şüpheliyi değil aynı zamanda şüphelinin baba tarafından tüm erkek akrabalarını dışlamakta, ejekulasyon olmasa dahi vaginal penetrasyon iddiası gibi durumlar söz konusuysa kullanılır. Tüm bunlara rağmen, ayırım gücünün diğer yöntemlere göre düşük olması, semenin kaynağını şüpheye yer bırakmayacak şekilde saptayamaması (otozomal analizlerle desteklenmedikçe ancak o aileden bir erkeğin fail olduğu söylenebilir) gibi nedenlerle kullanımında bazı sınırlamalar mevcuttur.

MİTOKONDRİAL DNA ANALİZİ

İnsan mitokondrial DNA’sı 16569 baz çifti uzunluğunda,sirküler yapıda bir moleküldür. Bazı adli amaçlı kimliklendirme olgularında nükleer DNA elde edilemez. Böyle durumlara sıklıkla, biyolojik örnek çok eski olduğunda, örnek olumsuz koşullarda saklandığında rastlanır. Oysa DNA degrade olsa bile mtDNA’nın elde edilebilmesi olasıdır. mtDNA’nın dış koşullara nükleer DNA’ya nazaran daha dayanıklı olmasının üç nedeni vardır:

-Her hücrede bir adet çekirdek DNA’sı bulunurken mtDNA’nın 1000-10000 adet bulunması,

-Mitokondrilerin, çift çeperli organeller olduğu için olumsuz koşullara direncinin yüksek olması,

-mtDNA’nın kapalı ve sirküler bir yapıda olması.

mtDNA analizi ayrıca, arkeolojik çalışmalar, antropolojik çalışmalar, büyük felaketler, toplu mezarlarda kimliklendirme çalışmalarında kullanılmaktadır.

Tüm bu yararlarına karşın yöntemin sınırlayıcı yönleri de bulunmaktadır. Bunlar arasında; birincisi kemiklerin mezardan çıkarılması sırasında insanla kontaminasyonu,

ikincisi doğal çürüme sürecinde bakteri, fungusla kontaminasyonu, üçüncüsü yöntemin uzun sürmesi ve masraflı olması, son olarak dahenüz her toplumun kendine

ait yeterli populasyon genetiği verilerinin bulunmaması sayılabilir.