FISH

Floresans In Situ Hibridizasyon (FISH)

FISH, sentetik nükleik asit dizileri (Prob) hücre içinde genomik DNA‟ya hibridizasyonu aracılığı ile genomik DNA‟daki yapısal ya da sayısal değişmeleri tespit etmeyi sağlayan bir tekniktir.

FISH tekniğinin kullanım alanlarına örnek olarak;

1. Prenatal sendromik tanımlamalarda,

2. Postnatal sendromik tanımlamalarda,

3. İnterfaz ve metafaz hücrelerinde aberasyon tanımlamalarında,

4. Dokuda enfeksiyon ajanlarının tanısında,

5. Gen haritalamasında,

6. Somatik hücre hibrit analizlerinde,

Klinikte kullanımı: Kromozomlarda meydana gelen yapısal ve sayısal anomalilerin belirlenmesinde kullanılır. Sayısal anomaliler bazı sendromlara sebep olmaktadır. Yapısal kromozomal anomaliler ise pek çok kanser türünün etyolojisinde önemli rol oynamaktadır.

Hibridizasyonda üç temel aşama önemlidir;

1. Hedef dizilerin hibridizasyon sırasında yeterince açık olması ve bu açıklığın yeterli süre korunması,

2. Probla hedefin yüksek affiniteyle birbirlerine bağlanması,

3. Hibridizasyonun spesifik aktivitesi yüksek bir işaretleyici ile görüntülenmesidir.

3) Multicolor-FISH

2) Fiber FISH

a) Spektral karyotipleme (SKY): Tekniğin esası beş farklı

renkte florokrom boya kullanılarak 24 kromozomun

eş zamanlı olarak farklı renklerde boyanması ve tek tip

bir floresans mikroskoptan analizine dayanmaktadır.

Aynı anda bir metafaz plağı üzerinde yer alan tüm

kromozomların farklı renkte görüntülenmesine ve birbirinden ayrılmasına imkan verir. Her bir kromozom kendine ait farklı bir floresansta izlenir.

İnterfaz kromatin lifleri kullanılarak DNA fragmentlerinin floresan boyalarla işaretlenerek daha yüksek rezolüsyonlu haritalama gerçekleştirilir. İnterfaz evresinde kromozomlar daha az kondanse oldukları için yoğunlukları metafaz evresinden daha düşüktür. İnterfaz durumunda birkaç yüz kb uzaklıkta olan belirleyiciler farklı renkteki boyalarla işaretlendiklerinde birbirlerine göre sıralarını belirlemek mümkün olmaktadır.

Klinikte kullanımı: Bu teknik ile 1.5 Mb‟nın (1 Mb: 10000 bp) altındaki parça değişimleri saptanabilir. Klasik bantlama tekniklerinden üstünlüğü çok küçük boyutlardaki anomalilerin daha kolay tanımlanabilmesine olanak vermesidir.

b) Multiplex FISH (M-FISH): SKY FISH‟te olduğu gibi 5 farklı florokromun çeşitli kombinasyonları ile hazırlanmış probların hibridizasyonuna ve farklı floresan sinyallerin analizine dayanan bir tekniktir. Beş farklı florokromdan yansıyan floresan ışığın bilgisayarda üst üste çakıştırılarak değerlendirilmesi esasına dayanır.

Fiber FISH’in Metafaz FISH ve İnterfaz FISH’ten farklı gösterimi

Klinikte kullanımı: Fiber FISH tekniği genetik hastalıkların tanımlanmasında son derece yararlı olmuştur. Çünkü bu teknik bir hastalıkla ilgili genin çevresindeki farklı genlerin sırası ve aralarındaki uzaklıklar hakkında detaylı bilgi verebilmektedir.

Klinikte kullanımı: Bu tekniğin sadece sentromer bölgesine özgü veya sadece telomer bölgesine özgü uygulanan tetkikleri de mevcuttur (speicher karyotipleme). Tüm kromozom kayıplarının belirlenmesinde tercih edilebilir.

c) Cobra-FISH (Combined binary ratio FISH): Bu teknikte diğer FISH yöntemlerinde farklı olarak 4 florokrom kullanılmaktadır. 24 kromozom iki ayrı grupta 12‟şerli olarak incelenir. Birinci grup 3 farklı florokromla incelenirken diğer gruba 4. bir florokrom ilave edilir. Florokrom sayısının çok fazla önemi yoktur 5 tane de kullanılabilir.

Klinikte kullanımı: Bu teknik genellikle kromozom kollarına özgü boyama sağladığı için tercih edilir .

d)CGH(Comparative Genomic Hybridization): temeli FISH’e dayanan, farklı floresan boya ile boyanmış test (hasta) ve referans DNA örneklerinin normal kromozomlara bağlanması ile elde edilen floresan renk farklılıklarını gösteren bir sitogenetik yöntemdir.

Yöntem ile hasta DNA’ sında kromozomal kayıp (loss) veya belli bir bölgenin amplifikasyonu (gain) gösterilir.

FISH tekniğinde kullanılan problar

3. Kırık noktası yeniden düzenlenme (break apart reaarangement) probları

1. Lokusa spesifik problar

Kırık noktası yeniden düzenlenme

4. α-satellit probları

p 53 mutasyonu (spektrum orange)

α satellit bölge

5. Tüm kromozom probları

2. Translokasyon probları

Tek füzyon (single fusion)

Çift füzyon (dual fusion)

Tek füzyon ekstra sinyal (extra signal)

Tüm kromozom boyama

t(9:22) tek füzyon translokasyonu

t(8:21) Çift füzyon translokasyon

6. Telomer probları

t(9:22) Tek füzyon ekstra sinyal translokasyon

Telomer bölge işaretleme

Prob; örneklerde aranan genetik materyale (DNA veya RNA) komplementer, radyoaktif veya nonradyoaktif (günümüzde floresan) madde ile işaretli DNA veya RNA segmentidir.

a)FISH için hazırlanan DNA problarının farklı amaçları vardır. Hazırlanan problar hibridizasyonda iki farklı şekilde bağlanırlar. Bunlar direkt işaretleme ve indirekt işaretleme şeklinde ayrılırlar.

b)İndirekt işaretleme için, prob hapten içeren modifiye nükleotidlerle oluşturulurken direk işaratlemede ise hazırlanan prob florokromun direk bağlandığı nükleotidlerle oluşturulur. Direk işaretleme yöntemi daha kısa sürede tamamlanmasına karşın floresan sinyalin kalıcılığı indirek işaretlemeye nazaran çok daha kısa sürelidir.

c)İşaretli prob ve hedef DNA denatüre edilerek tek zincirli hale getirilir. d)Komplementer dizileri ile hibridize olmak üzere probun lam üzerindeki hücresel DNA ile birleşir.

e)Eğer prob indirekt işaretli ise görüntüleme için fazladan bir uygulama daha yapılmalıdır. Floresan işaretleyicileri taşıyan ve haptenler tarafından yakalanacak olan antikorların ortama konulması gerekir.