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técnicas de biología molecular para el diagnóstico de infecciones osteoarticulares
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Biología Molecular
Natalia Vaca Ávila
Describir en qué consisten las técnicas de biología molecular para el diagnóstico de infecciones osteoarticulares, sus ventajas y limitaciones.
RAE
Introducción
1
- Complicaciones en pacientes ortopédicos:
- Infecciones
- Falta de métodos de diagnóstico (inconclusos)
- Tests de sangre: Proteína C reactiva/ Conteo de células
- Cultivo de téjidos: Tiempo/ falsos negativos
- DIAGNÓSTICO MOLECULAR
GLOSARIO
- PROTEÍNA C REACTIVA: Es una proteína producida en el hígado que se envía a traves de el torrente sanguíneo en respuesa a una inflamación
- INFLAMACIÓN/ INFECCIÓN
- CONTEO DE CÉLULAS: " Un hemograma completo (CBC, por sus siglas en inglés) es una prueba que mide las células que forman su sangre: glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas" (8)
- GB= infecciones
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
PCR
- Diagnóstico de enfermedades infecciosas
- Detectar gérmenes en nuestro organismo
¿Qué es?
"Algunas veces llamada "fotocopiado molecular", la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) es una técnica rápida y económica utilizada para "amplificar" - copiar - pequeños segmentos de ADN. Debido a que se necesitan considerables cantidades de una muestra de ADN para análisis moleculares y genéticos, los estudios de segmentos aislados de ADN son casi imposibles sin la amplificación por RCP"
PROCESO
(13)
CONCEPTOS
Conceptos
- Polimerasa: enzima capaz de transcribir o replicar ácidos nucléicos
- Taq Polimerasa: Enzima termoestable obtenida de una bacteria llamada Thermus aquaticus que vive en los geiseres
- Enzima termoestable (termoestable): no es afectada facilmente por la temperatura (y sus cambios)
- Ácidos nucléicos: material genético, ADN/ARN (nucleotidos)
GEN ribosomal 16S
GEN r16s
extraído de https://www.partesdel.com/gen.html
Solo en las bacterias
TITLE
FASES
- Desnaturalización
- Hibridación
- Elongación
FASES
CEBADOR/PRIMER: "Un iniciador o cebador se refiere a un número reducido de nucleótidos del ADN, por lo general de 18 a 24 pares de bases de longitud. Un cebador puede ser utilizado para muchos procesos experimentales diferentes. Se puede utilizar en una reacción de PCR para llegar a un locus determinado y así amplificarlo para su posterior análisis. Es una manera de seleccionar una secuencia muy especifica del ADN" (17)
CONCEPTOS
INICIADOR: unión de pocos nucleótidos que dan inicio al proceso (prerequisito/ punto de inicio)
¡IMPORTANTE!
Las polimerasas únicamente son
capaces de añadir nucleótidos al extremo 5’ libre del primer . Son necesarios por tanto moléculas cortas (entre 10 y 30 bases) de
DNA de cadena sencilla. Estas moléculas son los cebadores o primers
Así mismo la polimerasa solo lee de 3´a 5´
CONCEPTOS
2
DNA molde: segmento de ADN que se quiere replicar (amplificar)-> TARGET
DESNATURALIZACIÓN
Extraído de https://www.slideshare.net/karengabrielamarcillovalencia/desnaturalizacin-y-renaturalizacin-de-la-cadena-de-adn
Proceso en el cual las dos hebras de ADN se separan, para lo cual se necesita una temperatura de 94°
HIBRIDACIÓN
HIBRIDACIÓN
Segunda fase en la que se baja la temperatura para que los cebadores se unan a la hebra del ADN molde. Temperatura entre 35° y 60°
ESPECIFICIDAD
TEMPERATURA: mayor temp, más específica (dificulta la unión entre el cebador y la cadena molde) +exactitud
IONES DIVALENTES (cloruro de magnesio): más I.D, menos específica (facilita la unión entre el cebador y la cadena molde) - exactitud
SECUENCIA DE LOS CEBADORES: nucleotidos
ELONGACIÓN
ELONGACIÓN
"La enzima polimerasa incorpora
nucleótidos complementarios a partir del extremo 3’ libre de la región en que han
hibridado los cebadores. La temperatura a la que se lleva a cabo esta fase
depende de la enzima polimerasa empleada; si se utiliza Taq polimerasa la
temperatura de elongación suele ser de 72ºC. "
IMAGEN
Extraído de: https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%C3%B3n%20en%20cadena%20de%20la%20polimerasa.pdf
TERMOCICLADOR: Máquina que regula mediante ciclos la temperatura
TERMOCICLADOR
Extraído de https://www.google.com/url?sa=i&source=images&cd=&ved=2ahUKEwiQ2Yeny7LgAhWLzlkKHdxFCXYQjxx6BAgBEAI&url=https%3A%2F%2Fbiologia.laguia2000.com%2Ftecnicas-en-biologia%2Fexplicando-el-protocolo-de-la-pcr&psig=AOvVaw1DhDSWISWKIiEH4i2EkfVI&ust=1549936969285123
UTILIDAD
Identificar la codificación (secuencia de nucleotidos) del gemén y así poder efectuar un tratamiento adecuado
DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES
extraído de http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm
CARACTERÍSTICAS
- GEL
- Cátodos
- Carga del ADN
- Longitud y velocidad (carga)
- Diseño de primers (distancia de separación)
- Comparación con BACTERIA
ELECTROFÓRESIS
VENTAJAS
- Identificar casi que cualquier bacteria sin conocer previamente sus características
- Fáciles de realizar en laboratorios dotados de utensilios especializados
- "Pueden detectar bacterias en pacientes con tratamiento antibiótico"
- Pueden detectar microorganismos que no crecen habitualmente en cultivos
- Puden ser más rápidos que otros métodos (de 24h-48h)
VENTAJAS
DESVENTAJAS
- Puede retrasar el proceso debido a su duración
- Caros y poco abordables para algunos laboratorios
- No permiten la detección de infecciones polimicrobianas (secuenciación)
- La presencia de ADN no indica viabilidad de los organismos
DESVENTAJAS
GRACIAS POR SU ATENCIÓN
1. Article title: Electroforesis en gel
Website title: Khan Academy
URL: https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/gel-electrophoresis
2. Article title: Prueba de proteína C reactiva (PCR): Información en MedlinePlus sobre pruebas de laboratorio
Website title: Medlineplus.gov
URL: https://medlineplus.gov/spanish/pruebas-de-laboratorio/prueba-de-proteina-c-reactiva-pcr/
3.Article title: Análisis de la proteína C reactiva - Mayo Clinic
Website title: Mayoclinic.org
URL: https://www.mayoclinic.org/es-es/tests-procedures/c-reactive-protein-test/about/pac-20385228
4.Author Enfermedades A-Z
Article title: Cómo se hace una PCR
Website title: Webconsultas.com
URL: https://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/como-se-hace-una-pcr
5. Website title: Seimc.org
URL: https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimientomicrobiologia34.pdf
6.Website title: Aeped.es
URL: https://www.aeped.es/sites/default/files/documentos/osteomielitis.pdf
Referencias
8.Author Flu & Cough Cold
Article title: What Is a Complete Blood Count?
Website title: WebMD
URL: https://www.webmd.com/a-to-z-guides/complete-blood-count#1
9. Author Enfermedades A-Z
Article title: PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)
Website title: Webconsultas.com
URL: https://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/pcr-13299
10. Article title: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Website title: Khan Academy
URL: https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr
11.Article title: Reacción en cadena de la polimerasa (RCP)
Website title: National Human Genome Research Institute (NHGRI)
URL: https://www.genome.gov/27562618/reaccin-en-cadena-de-la-polimerasa-rcp/
12.Article title: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): Conceptos Básicos
Website title: YouTube
URL: https://www.youtube.com/watch?v=mslMRgxbdOA
13.
Article title: PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa (divulgación científica IQOG-CSIC)
Website title: YouTube
URL: https://www.youtube.com/watch?v=TalHTjA5gKU
Referencias
Referencias
14.Author:Universidad politécnica de Valencia
Institution: UPV
title: Riunet.upv.es
URL: https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%C3%B3n%20en%20cadena%20de%20la%20polimerasa.pdf
15. Article title: ETAPAS DE UN PROCESO PCR
Website title: Equiposylaboratorio.com
URL: https://www.equiposylaboratorio.com/sitio/contenidos_mo.php?it=16764
16. Authors:Joel Cerna Cortes, Jorge Francisco Cerna Cortés, Mario Roberto Bernabé Guapillo Vargas. Facultad de Medicina
Instituto: Universidad de Colima, Colima.
Article title: Taq polimerasa: De los geiseres a la ciencia
Website title: Utm.mx
URL: http://www.utm.mx/edi_anteriores/temas54/T54_2Notas2-Taq%20polimerasa%20-%20De%20los%20geisers%20a%20la%20ciencia.pdf
17. Website title: National Human Genome Research Institute (NHGRI)
URL: https://www.genome.gov/glossarys/index.cfm?id=163
18. Author: Laboratorio de Genética Forense y Genética de Poblaciones
de la Universidad Complutense de Madrid
Website title: Ucm.es
URL: https://www.ucm.es/data/cont/docs/635-2013-12-17-ADN%20sample_pdf2.pdf
19.Authors: Laura Espinosa Asuar
Article title: Guía práctica sobre
la técnica de PCR
Website title: Www2.inecc.gob.mx
URL: http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/530/cap17.pdf
20.
Author Enfermedades A-Z
Article title: Resultados de la PCR
Website title: Webconsultas.com
URL: https://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/resultados-de-la-pcr-13303
21.Author Miguel Gobernado
Article title: Identificación bacteriana
Website title: Elsevier.es
URL: http://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas-microbiologia-clinica-28-articulo-identificacion-bacteriana-13059086