Fases del proceso de clonación

PREPARACIÓN DEL ADN QUE SE VA A CLONAR

Partiendo de ADN genómico completo...

• ADN bicatenario con extremos cohesivos (enzima de restricción)

Partiendo de un solo gen...

• PCR
• Unión: amplicones con A extra en 3' + vectores-T

PREPARACIÓN DEL VECTOR DE CLONACIÓN

Digerir vector con misma enzima que ADN

INSERCIÓN DEL ADN EXTRAÑO EN EL VECTOR

-Mezclar e incubar ADN y vector

-Ligación: ADN ligasa

-Creación de vector recombinante

Tras ligación...

• 1 vector recombinante específico
• Productos no deseados (se deben eliminar)

TRANSFORMACIÓN BACTERIANA

Captación e internalización de ADN desnudo en una bacteria

Bacterias competentes: E. Coli

Tratamiento químico (CaCl2) y físico (choque térmico): aumento permeabilidad

Siembra en placas con medio de cultivo sólido

TRANSFECCIÓN

Introducción de vectores en células eucariotas sin mediación de virus

Empleo de agentes químicos

Añadir vector a tampón con Ca3(PO4)2 sobre cultivo en monocapa

Coprecipitación del vector con fosfato cálcico sobre membranas

Endocitosis o lisosomas

TRANSDUCCIÓN

Infección células hospedadoras

#1

#3

#2

Vector se empaqueta en cápside

Material genético en células

FAGOS LAMBDA RECOMBINANTES O CÓSMIDOS

Secuencias cos en los extremos

Empaquetamiento: mezclar vector recombinante con proteínas de la cápside

De forma natural se forman partículas víricas con vectores

Infección de cultivo sensible, los viriones introducen vector en bacteria

FAGO RECOMBINANTE

Ciclo lítico (contiene genes necesarios)

CÓSMIDO

Interior bacteria: circularización gracias a extremos cohesivos de las secuencias cos, comportamiento de plásmido

ELECTROPORACIÓN

Aplicar pulsos eléctricos cortos y de alto voltaje a células en suspensión y vectores en solución

Aumentar permeabilidad membranas

#3

#1

#2

Vectores pasan al interior de la célula

Aplicar pulsos eléctricos

BACTERIAS LAC -

+

VECTOR RESISTENTE ANTIBIÓTICO

VECTORES DE EXPRESIÓN

Producción a nivel industrial de proteínas recombinantes de interés:

-Médico y farmacéutico: insulina, hormona del crecimiento, factor VIII, vacunas, reactivos...

-Industria química y de alimentación: enzimas y catalizadores

-Medioambiental: microorganismos metabolizantes del petróleo, tóxicos y de desecho

INSERCIÓN DE GENES EN GENOMAS VEGETALES O ANIMALES

Avances en agricultura, acelerando la mejora genética, caracteres de interés a plantas y animales

Individuos resistentes a enfermedades y productos tóxicos, más fértiles...

Se denominan organismos transgénicos (GMO)

Sometidos a legislación

RATONES TRANSGÉNICOS

Aquel al que se le ha modificado su ADN, por introducción de un gen nuevo o por eliminación de uno propio

Estudio de enfermedades genéticas; comprensión y tratamiento

RATONES KNOCKOUT

Se inactiva un gen; deleción de gran parte o inserción que irrumpa la secuencia codificante del gen a inactivar

RATONES KNOCKIN

Gen normal sustituido por gen mutado (mutagnénesis dirigida)

TERAPIA GÉNICA

Transferir genes normales a células somáticas para corregir enfermedades genéticas

Conseguir que las células sinteticen el producto sin fármacos