1ERE SPE-SVT THEME 3B ACTIVITE 5

Principe du sérodiagnotic

Le sérodiagnostic est une technique de recherche de la présence ou de l'absence d'anticorps donnés dans le sérum (partie liquide du sang de couleur jaunâtre, dépourvue des différentes cellules et protéines de coagulation) d'un individu.

La présence de nombreux anticorps dans un sérum à tester entraîne la formation de complexes immuns à l'échelle moléculaire dont les conséquences sont visibles à l'oeil nu (échelle macroscopique).

Principe du sérodiagnotic

A l'échelle moléculaire, les complexes immuns sont des complexes moléculaires insolubles, résultant de liaisons chimiques entre deux types de molécules: les anticorps et les antigènes.

C'est par l'extrémité des "bras" des anticorps que se fixe une partie de chaque antigène. Les antigènes sont alors immobilisés et neutralisés. Ainsi, ils ne peuvent plus exercer leur action pathogène. Ces complexes seront ensuite éliminés par les phagocytes de l'immunité innée.

A l'échelle macroscopique, les nombreux complexes immuns insolubles provoquent un précipité ou agglutination au sein du sérum sanguin, tout à fait visible à l'oeil nu.

Celle-ci est associée à un sujet séropositif pour l'antigène étudié.

Dans le cas contraire, en l'absence d'anticorps, aucun complexe immun ne se forme et le sujet est dit séronégatif pour l'antigène étudié.

Protocole expérimental

La protéine S (spike) est l’élément de l’enveloppe du SARS-CoV-2 qui reconnaît le récepteur ACE2 présent à la surface des cellules cibles. C'est l'antigène qui sera fixé par les anticorps de la réponse adaptative.

Protocole expérimental

Matériel disponible:

• 3 puits
• agitateurs (cures-dents)
• gants
• lunettes
• bécher
• solution S : suspension de protéines S du virus Sars Cov2 (antigène): voir schéma ci-dessus
• 3 sérums à tester

1/ sérum A : Monsieur A, séropositif, a guéri du covid, teste RT-PCR négatif (témoin positif: présence d'anticorps anti-spike)

2/ sérum B: Monsieur B, séronégatif, jamais contaminé , test RT-PCR négatif (témoin négatif: présence d'anticorps anti-spike)

3/ sérum X: Madame X dont on veut établir le statut sérologique (séropositivité ou non)

Expérience:

• Afin de respecter les consignes de sécurité: blouse fermée, lunettes, cheveux attachés et gants sont obligatoires. Aussi, une organisation irréprochable de la paillasse (et sac sous la paillasse) est attendue.
• Déposer 2 gouttes de chacun des sérums à tester dans un puits différent.
• Déposer 2 gouttes de solution S dans chaque puits, sans toucher les solutions présentes et éviter toute contamination.
• En utilisant une extrémité différente des cure-dents pour chaque puits, mélanger sérum/solution S.

RESULTATS SECOURS

Principe du test d'Ouchterlony

A l'échelle macroscopique

Principe du test d'Ouchterlony

La méthode d'Ouchterlony ou immunodiffusion sur gel est une technique qui peut être utilisée pour tester la spécificité d'un anticorps vis-à-vis d'un antigène.

Contrairement au sérodiagnostic qui se fait à partir du mélange de sérums dans un puits, ce test utilise la capacité de diffusion des molécules d'antigène et d'anticorps au sein d'une gélose (gel d'agarose) coulée et refroidie dans une boîte de Pétri. Les solutions déposées dans les puits creusés dans le gel diffusent de façon homogène dans toutes les directions autour de chaque puits. Deux auréoles de diffusion peuvent alors entrer en contact lorsqu'elles ont suffisamment progressé.

Le point commun avec le sérodiagnotic réside dans la mise en évidence à l'oeil nu (échelle macroscopique) de la formation d'un complexe immun (échelle moléculaire). Cependant, la précipitation qui en découle est visible dans ce test par un arc de précipitation et non par une agglutination du sérum.

A l'échelle macroscopique:

• Si les antigènes sont neutralisés par les anticorps testés, alors on observe un arc de précipitation.
• Dans le cas contraire, aucun arc n'est visible sur le gel.

A l'échelle moléculaire:

• si les antigènes sont neutralisés par les anticorps testés, il y a formation de complexes immuns.
• dans le cas contraire, il n'y a pas de complexe immun formé.

A l'échelle moléculaire

Protocole expérimental

GABARIT

Protocole expérimental

Expérience:

1/ Afin de respecter les consignes de sécurité: blouse fermée, lunettes, cheveux attachés et gants sont obligatoires. Aussi, une organisation irréprochable de la paillasse (et sac sous la paillasse) est attendue.

--> Attention, le gel d'agarose se comporte comme une éponge à l'échelle microscopique !

2/ Suivre le gabarit pour creuser verticalement 5 puits à l'aide de l'emporte-pièce. Retirer les bouts de gel délicatement avec la pointe.

3/ Déposer la même quantité d'antigènes et de sérum testé dans les puits en suivant le gabarit: une seule petite goutte avec une micropipette différente SANS DEBORDER !

4/ Fermer la boîte de Pétri avec son couvercle et attendre le temps nécessaire à la migration des produits dans le gel (observation des résultats avec feuille noire sous la boite)

5/ Après chaque usage, la pipette doit être placée dans un bécher avec javel = sécurité

Matériel à utiliser:

- un gel d'agarose (matière poreuse et gélatineuse permettant la migration de molécules) chaud a été coulé dans une boîte de Pétri. Il est maintenant solide après refroidissement.

- 5 pipettes + gants + lunettes+ blouse

-gabarit en papier(dessin des puits à creuser dans le gel avec position des solutions à déposer dans les puits).

-emporte-pièce (pour creuser les puits dans le gel)

-cure-dent (pour récupérer l'échantillon de gel découpé et le retirer délicatement de la boîte de Pétri)

- papier noir et lampe

- bécher avec javel (lieu de dépot des pipettes)

-1 solution S d'anticorps à tester de Madame X

- 4 solutions d'antigènes différents:

• solution A :antigène du sarsCov2 : protéine S (étiqueté A)
• solution B :antigène du virus grippal H1 (étiqueté B)
• solution C: antigène de bactérie brucella (étiqueté C)
• solution D :antigène du VIH (étiqueté D)

RESULTATS SECOURS

PIPETTE PASTEUR: mode d'emploi

PIPETTE PASTEUR

AVANT TOUTE MANIPULATION , IL EST INDISPENSABLE DE LIRE ET RESPECTER LES INDICATIONS CI-DESSOUS:

Pour le réglage de la micropipette sur 70 microlitres --> voir explication ci-contre.

Chaque embout de pipette ainsi que chaque agitateur en plastique est à usage unique et ne doit pas être contaminé par une autre solution (l'embout de la pipette ne doit pas être en contact avec le contenu du puit)

Après chaque usage l'embout de la pipette et l'agitateur doit être placé dans un bécher avec javel = sécurité

Doc 1: Les anticorps, des molécules complexes

DOC 1

Un fragment Fab est un segment d'une immunoglobuline obtenu grâce à l'hydrolyse par la papaïne. L'extrémité de ce fragment est le site anticorps de fixation de l'antigène.Puisque les anticorps sont en forme de Y, le fragment Fab correspond aux bras de l'anticorps.

Le fragment cristallisable (Fc) est la queue de l' anticorps.

DOC 1A: Molécule d'anticorps: immunoglobuline (modèle obtenu sur Libmol)

DOC 1B: Schéma structural d'un anticorps

Doc 2: Variabilité et spécificité des anticorps vis à vis des antigènes

3 sites anticorps différents entre l'anti-prion, anti P24 du VIH et l'anti-GP120 du VIH

DOC 2

Détail de la zone d’interaction antigène/anticorps (site anticorps)

Doc 3: Variabilité et spécificité des anticorps vis à vis des épitopes

DOC 3

Un antigène, plusieurs épitopes reconnus par des anticorps spécifiques