CTV - Protoplasto - S

CÉLULA VEGETAL

PROTOPLASTO

O conteúdo vivo de uma célula, composto pelo núcleo, pelo citoplasma e pela membrana plasmática.

Nas células vegetais esse conteúdo exclui os vacúolos e a parede celular.

Desenvolvimento de um sistema de transfecção de protoplastos rápido e de baixo custo para switchgrass (Panicum virgatum L.)

Transfecção é o processo de introdução intencional de ácido nucleicos nas células.

Com o advento das tecnologias de edição de genoma e silenciamento de genes, os sitemas de protoplasto descobriram utilidade adicional devido à facilidade em rastrear a eficiência de numerosos alvos, antes do desenvolvimento de plantas transgênicas.

Obtenção de plantas transgênicas sem a necessidade de transformação mediada por Agrobacterium.

Dificultado pelo alto custo das enzimas que degradam a parede celular, pela grande quantidade de DNA necessário para a transfecção, pela necessidade de uma fonte constante de tecido para isolamento, e regeneração e fertilidade de plantas regeneradas.

O capim-colchão (Panicum Virgatum L.), possuiu uma viabilidade econômica tanto na agricultura quanto na produção de biocombustível.

MATERIAIS E MÉTODOS

Sementes foram obtidas da Bemert Seed (Texas, EUA);

Solo Fafard 3B;

Cultivado com 16 horas de luz e 4 horas de ciclo escuro;

Temperatura de 22 ºC;

Para colheitas iniciais, as plantas forma cultivadas durante 2 semanas e depois as folhas foram cortadas com um bisturi a aproximadamente 1,5 cm acima do solo e usadas para isolamento de protoplasto.

MATERIAIS E MÉTODOS

Fig. 1 Esquema de "gramados" de "switchgrass" demonstrando fase

de crescimento do tecido foliar quando colhidos de cada quadrante

(Q1, Q2, Q3, Q4) aos 8, 14, 22 e 29 dias após o plantio e rebrota aos

7, 14 , 21 e 28 dias após o corte completo do tecido.

MATERIAIS E MÉTODOS

As culturas em suspensão foram mantidas no meio KM8 com adição de:

20 % de sacarose,

10% de glicose,

0,025% de frutose;

0,025% de sorbitol,

0,025% de manitol

0,2 mg/l de zeatina,

1 mg/l de NAA,

0,1 mg/l de 2,4-D (Kao e Michayluk, 1975),

Protoplastos foliares foram isolados do tecido mesofilo em solução tampão (manitol 0,6 M, MES 10 mM, CaCl2 1 mM, 2-mercapetanol 5 mM e 0,1% de BSA, pH 5), contendo enzimas de grau alimentício nas concentrações sugeridas pelo fabricante e filtradas através de um filtro de seringa de 0,22 μm.

Tecido de folhas cortadas foi adicionado à solução de tampão enzimático (cerca de 200 mg de tecido / 10 mL de solução) e incubado com agitação a 80 rpm por 30 min a 24 h, a 28, 37 ou 55 ºC (temperatura máxima ideal de enzimas grau foi de 60 ºC) com ou sem proteção da luz ambiente.

Após a incubação, o tecido e a mistura de tampão foram filtrados através de um filtro de 40 μm. Os protoplastos foram coletados e a solução enzimática foi removida por centrifugação a 150xg, 22 ºC por 10 min.

Os protoplastos foram então ressuspensos em solução W5, enumerados, e a viabilidade foi avaliada utilizando coloração com iodeto de propídio (PI). Os protoplastos foram colocados no gelo após o isolamento e antes da transfecção.

ISOLAMENTO DE PROTOPLASTO

PLASMÍDEO

O plasmídeo pANIC10A contendo o gene repórter fluorescente alaranjado de pporRFP (OFP) sob o controlo do promotor constitutivo de grampo PvUbi1-3 foi utilizado neste estudo (Mann et al. 2011). Para criar um plasmídeo que pudesse ser prontamente isolado da Escherichia coli padrão, o gene mGFP5-ER foi inserido na orientação reversa usando clonagem Gateway®, para remover o cassete ccdB, para gerar o plasmídeo de encapsulamento pANIC10A GFPuv de 16 kb que foi usado para todas as transfecções experimentos. Este plasmídeo foi propagado em E. coli e purificado utilizando um kit ZymoPURE Giga Prep (Zymo Research, Irvine, CA).

Os protoplastos foram ressuspensos em MMg (manitol 0,4 M, MgCl2 25-150 mM, MES 4 mM (pH 5,7)) a uma concentração de 1x10^6 protoplastos / mL (folha) ou 2x10^5 protoplastos / mL (células suspensão). DNA de plasmídeo (0-40 μg) foi misturado com 200 μL de protoplastos.

Aproximadamente 0 a 50% de solução de PEG (manitol 0,6 M, CaCl2 100 mM, PEG 4000 0-50% foi adicionada aos próstoplastos para uma concentração final de PEG de aproximadamente 0-25%.

Após uma incubação de 20 min à temperatura ambiente, os protoplastos foram lavados duas vezes com aproximadamente 1 a 4 mL de W5 e recolhidos por centrifugação a 100xg durante 5 min.

Os protoplastos foram ressuspensos em 1 mL de WI (manitol 0,6 M, KCl 4 mM, MES 4 mM, pH 5,7), transferidos para placas de cultura Falcon de 12 poços e incubados a 28 ºC no escuro por 15-20 h.

A avaliação microscópica da expressão do repórter pporRFP foi realizada utilizando um microscópio Olympus IX71 com o conjunto de filtros Chroma 49004 CY3 / TRITC.

TRANSFECÇÃO MEDIADA POR PEG

O número de protoplastos que expressam o OFP e o número de protoplastos não expressam OFP foram contadas utilizando um hemocitómetro. Para assegurar que uma distribuição estatisticamente significativa dos protoplastos fosse contada no hemocitômetro, amostras foram coletadas de poços individuais e centrifugadas a 100xg antes da ressuspensão em um volume mínimo * 100 μL. Utilizando esta estratégia, uma média de 78,9 protoplastos, em todos os experimentos de transformação, foram contados em cada grade de hemocitômetro.

ANÁLISE

ESTATÍSTICA

RESULTADOS

ANÁLISE DE UMA FONTE RENOVÁVEL DE TECIDO FOLIAR DE GRAMÍNEAS

OTIMIZAÇÃO DA TRANSFECÇÃO DE PROTOPLASTOS DE SWITCHGRASS

ISOLAMENTO E TRANSFECÇÃO DE PROTOPLASTO DERIVADOS DE CULTURA CELULAR

Independente do método de isolamento de protoplasto entre o mesofilo e os protoplastos derivados da cultura celular, o protocolo otimizado de transfecção foi significativamente mais eficiente com os protoplastos derivados da cultura celular isolados a 28° C, com uma eficiência de 46,4 ± 3,3% (p<0,05). Surpreendentemente, houve uma redução significativa na eficiência de transformação dos protoplastos derivados da cultura celular (25,4 ± 3,3%) isolados a 37ºC.

Muitas vezes, as enzimas de laboratório para o isolamento de protoplastos são muito caras, com o custo da enzima muitas vezes proibitivo para pesquisas de alto rendimento.

DISCUSSÃO

Com base na metodologia anterior para o isolamento de protoplasto de switchgrass de aproximadamente 130 mg de tecido foliar, o custo por reação foi de US$ 11,59 somente para as enzimas. Considerando que cada reação gerou aproximadamente 8x10^5 protoplastos, e possivel um máximo de quatro experimentos de transfecção (tipicamente 2x10^5 protoplastos são usados para transfecção) poderia ser conduzido por reação, com um custo por transfecção de US$ 2,89 apenas para as enzimas.

Usando essas enzimas, foi possível reduzir o custo do isolamento do protoplasto de mesófilo para aproximadamente US$ 0,01 por reação, uma diminuição maior que 1000 vezes em comparação com os métodos anteriores. Além disso, a concentração de enzimas usadas foi capaz de digerir 1,6 g de tecido, liberando 1,5x10^6 protoplastos por reação, quase dobrando o rendimento de protoplastos de mesofilo em comparação com os métodos anteriores.

DISCUSSÃO

DISCUSSÃO

Pesquisas anteriores observaram que a diminuição do DNA frequentemente reduz os custos de mão-de-obra e materiais, enquanto aumenta a eficiência da transformação de protoplastos.

Especificamente para switchgrass, a eficiência da transformação baseada em Agrobacterium é inconsistente e pode depender do genótipo, tipo de calo e idade do calo. Além disso, uma alta frequência de falsos positivos, até 30%, foi relatada a partir de transformação de calos de switchgrass.

DISCUSSÃO

O aumento mais significativo na eficiência de transformação foi alcançado aumentando a concentração de MgCl2 de 15mM para 100-125 mM.

Através da otimização do procedimento de transfecção, foi possível aumentar a eficiência da transformação de protoplasto de 9,1 para 30,4%, reduzindo também a quantidade de DNA em quatro vezes.

DISCUSSÃO

Embora o sistema de isolamento de protoplasto desenvolvido neste trabalho tenha utilidade em aplicações de triagem de alto rendimento, pesquisas futuras serão voltadas para o exame do potencial de regeneração de protoplastos isolados utilizando essa metodologia.

DISCUSSÃO

REFERÊNCIAS

OLIVEIRA, R.P. Cultura de calos, células em suspensão e protoplastos de porta-enxertos de citros. 117f. Dissertação (Mestrado) - Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 1993.

MENDES-DA-GLÓRIA, F.J. Hibridação somática entre laranja-‘Caipira’ e limão-‘Cravo’ através de fusão de protoplastos. 78f. Dissertação (Mestrado) – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 1998

Protoplasto vegetal - Disponivel em: <abctp.org.br/arqSite/Palestra__Protoplastos_vegetais__Wagner_Otoni__II _CBCTP.pdf> Acesso em 04.junho.2019

Protoplasto - Disponivel em: <https://www.conhecimentogeral.inf.br/protoplasto/> Acesso em 04.junho.2019

Celula Vegetal - UNISANTA - Disponivel em <https://professores.unisanta.br/maramagenta/celulavegetal.asp> Acesso em 04.junho.2019

Isolamento e eficiência de plaqueamento de protoplastos de citros - USP - Disponivel em <http://www.scielo.br/pdf/%0D/rbf/v24n2/a38v24n2.pdf> Acesso em 04.junho.2019