apresentação docduilio

1. introdução

• Os avanços na medicina e na ciência fez surgir inúmeras opções de medicamentos sintéticos para tratamento das mais diversas enfermidades.

• O potencial de plantas serem fonte de produtos naturais capazes de trazer benefícios à saúde, ocorrendo assim intensos estudos visando a terapia natural.

• Busca de compostos com potencial a eficazes no processo de cicatrização.

• Tratamentos eficazes e com menores custos são alvos de novas pesquisas no contexto farmacológico atual.

1. Introdução

• Resgate da prática milenar, presente desde os primórdios da humanidade e baseada no conhecimento passado por gerações, de tratar e curar enfermidades por meio de plantas medicinais.

Filoctetes, ferido, é abandonado pela expedição grega a caminho de Tróia, detalhe de um stamnos ca. 460 aC (Musée du Louvre)

2.Revisão bibliográfica

A CICATRIZAÇÃO:

- Cascata de eventos celulares e moleculares.

- Reconstituição do tecido reparação em um período de 3 meses.

- As feridas podem ser agudas traumáticas ou cirúrgicas.

- Tempos previsíveis

Medical artist´s interpretation ;1990

2.Revisão Bibliográfica

EXIGE CONHECIMENTOS :

-Anatomia, histologia, bioquímica, imunologia e farmacologia.

-A perda tecidual pode atingir a derme completa ou incompletamente, ou mesmo atingir todo o órgão, chegando ao tecido celular subcutâneo.

-A reparação faz-se pela reepitelização dos anexos epiteliais da pele adjacente não acometida.

2.Revisão Bibliográfica

O PROCESSO CICATRICIAL É COMUM A TODAS AS FERIDA

- É sistêmico e dinâmico e está diretamente relacionado às condições gerais do organismo.

- A cicatrização de feridas consiste em perfeita e coordenada cascata de eventos celulares.

Classificação esse processo em 3 fases divididas:

1-Fase inflamatória,

2-Fase de proliferação

3-Fase de remodelação ou de maturação.

(Urdiales ; 2006)

2.Revisão Bibliográfica

Fases da cicatrização

(DEALEY, 2001).

2.Revisão Bibliográfica

Etapas do processo angiogênico:

ativação de células endoteliais, secreção de proteases e degradação da membrana basal

A figura 2 retrata as fases do processo angiogênico, na qual se vê: em (A) a ativação de células endoteliais, (B) a secreção de proteases que irão degradar a membrana basal e a matriz extracelular, (C) a formação do broto capilar após migração das células, (D) o crescimento do vaso; (E) a formação do lúmen e da nova membrana basal; (F) a união de dois brotos para formar a alça capilar e (G) a formação da segunda geração de brotos capilares.

2.Revisão Bibliográfica

• Atualmente, existem diversos recursos para ajudar no processo de cicatrização (2.500);

• Reconhecimento e incentivada pela OMS a partir de 1978;

• Medicamentos obtidos exclusivamente de origem vegetal,

com princípios ativos para fins terapêuticos .

• A utilização de plantas medicinais, com a finalidade profilática, paliativa e com fins de diagnóstico.

(BRASIL, MS, 2006 ; WU et al., 2012)

2.Revisão Bibliográfica

RDC22/2014

2.Revisão Bibliográfica

Asteraceae

-É a segunda maior família do grupo que apresenta flores em sua composição.

-23.000 espécies.

-Florestas nativas do território brasileiro apresentam grande diversidade de espécies.

Vanillosmopsis erythropappa

Schultz – Bip

Família Asteraceae.

(DUTRA et al., 2010).

2.Revisão Bibliográfica

Vanillosmopsis erythropappa Schultz – Bip

A candeia apresenta um grande potencial econômico.

• Óleos essenciais e farmacêuticas - Alemanha e Japão

• Responsáveis pelo cheiro característico na queima.

• Esses óleos exibem propriedades ,antibacteriana, antimicótica e dermatológica.

(DUTRA et al., 2010)

2.Revisão Bibliográfica

Áreas de ocorrência e exemplar de espécie

(www.reflora.jbrj.gov.br)

2.Revisão Bibliográfica

Estudos dos constituintes fitoquímicos

(SILVERIO, 2004; SILVERIO et al., 2008).

3.Objetivos

Gerais

-Avaliar o efeito cicatrizante da pomada obtida a partir dos extratos das folhas de Vanillosmopsis erythropappa Schultz – Bip

-Avaliando , in vitro e em in vivo através de feridas cutâneas induzidas em ratos

3.Objetivos

Específicos

Obter os extratos das folhas de V. erythropappa Schultz– Bip;

Avaliar o efeito dos extratos, empregando o teste de proliferação celular in vitro em culturas celulares de fibroblastos humanos;

Avaliar a atividade antibacteriana dos extratos obtidos sobre Sthaphilococcus aureus;

Avaliar o extrato ativo por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas CG/MS, bem como a identificação de substâncias biotivas;

Avaliar o extrato ativo por cromatografia líquida LC/MS acoplada a espectrometria de massas, bem como a identificação de substâncias biotivas;

Avaliar o efeito cicatrizante do extrato ativo das folhas de V. erythropappa Schultz– Bip in vivo.

Análise qualitativa do colágeno, bem como a identificação e quantificação das fibras colágenas.

4. Material e métodos

• Coleta do material, Ouro Preto MG, no distrito de Lavras Novas, catalogadas no Herbário da UFV e posteriormente processadas até formulação ser preparada.

• As formulações foram obtidas em concentrações específicas (1%, 3% e 5%) do extrato ativo.

• O perfil do extrato ativo também foi analisado através da CG/MS

• Alíquotas de 300 µL dos extratos foram colocadas em frascos e 5 µL injetados no sistema LC/MS no Núcleo de Biologia Molecular (NuBioMol) da UFV

4. Material e métodos

Os 90 animais foram distribuídos aleatoriamente em cinco grupos.

(Tabela 1)

4. Material e métodos

Grupos experimentais

4. Material e Métodos

• Atividade Antimicrobiana, Microrganismos e Meio de Cultivo - CIM

• Avaliação da Proliferação Celular in vitro.

• Avaliação da Proliferação Celular in vivo - Para a realização do estudo, foram aplicados os princípios éticos da experimentação, CEUA da UFV.

• Procedimento Cirúrgico - Os animais passaram por anestesia prévia com acompanhamento Médico veterinário.

• Análises Macroscópicas das Feridas - avaliadas pelo Índice de Contração (IC), mensurado no 7°, 14° e 21° dias.

4. Material e métodos

Teste de proliferação celular in vitro em culturas celulares de fibroblastos

O meio de cultura RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino inativado (SFB, 10%), penicilina (100 UI/ml) e estreptomicina (100 micro g/ml).

Os fibroblastos humanos (NIH3T3) mantidos em estufa, a 37° C, num ambiente enriquecido por CO2 a 5%.

5000 células por poço em uma placa de 96 poços.

O meio de cultura anteriormente adicionado (RPMI, 10% SFB) substituído por meio novo acrescido do extrato de folhas de candeia .

Incubada nas mesmas condições por mais 48h, aos poços, foram adicionados 200microL de DMSO.

As Amostras foram lidas ELISA em 540 nm.

ONNUSAMYet al. (2015).

4. Material e Métodos

• Análises Quantitativa do Colágeno

• Imunoistoquímica para VEGF - As alíquotas usadas para o VEGF foram congeladas a -80ºC para posterior análise, através do kit Human VEGF Elisa Kit invitrogen®

4. Material e Métodos

Eutanásia

Após 7, 14 e 21 dias de tratamento, seis animais de cada grupo foram eutanasiados segundo as diretrizes brasileiras de prática de eutanásia (BRASIL, 2012).

Posteriormente,segui-se a exsanguinação por punção cardíaca, a fim de obter amostras de sangue para análises bioquímicas.

Finalmente, a eutanásia foi realizada por choque hipovolêmico

(BORGES et al., 2007).

6. Resultados e discussão

Análise Antibacteriana dos Extratos Etanólico e Hexânico

De acordo com os resultados obtidos no teste em todas as placas testadas, o extrato de hexânico de Vanillosmopsis erythropappa Schultz – Bip não foi efetivo para inviabilizar as bactérias em teste. Já o extrato etanólico de Vanillosmopsis erythropappa Schultz – Bip foi muito efetivo, inviabilizando as bactérias na menor concentração testada (0,0625 mg/ml)

6. Resultados e discussão

Análise da Proliferação Celular In Vitro em Culturas Celulares

6.Resultados e discussão

Análise do Extrato ativo por Cromatografia Gasosa - espectroscopia de massa (CG/MS)

6. Resultados e discussão

Análise do Extrato ativo por Cromatografia Gasosa - espectroscopia de massa (CG/MS)

Figura 12 – Cromatograma do extrato hexânico das folhas de V. erythropappa Schultz – Bip obtido pela análise de CG-EM. Picos numerados de 1 a 9: 1) α-cariofileno; 2) 2-metil-hexacosano; 3) Tetracontano; 4) Lupenona; 5) Acetato de Lupeol; 6) α -amirina; 7) Lupeol; 8) Friedelan-3-one; 9) Acetato de Lupanol, correspondem aos compostos de maiores intensidades no extrato

6. Resultados e discussão

Análise do Extrato ativo por Cromatografia Líquida (Método LC/MS) Apigenina e Luteolina

6. Resultados e discussão

Análises dos Resultados de Feridas Tratadas com Extrato de V. erythropappa Schultz – Bip

No período do estudo não houve sinais de desenvolvimento de infecção nas feridas e os parâmetros clínicos dos animais, como higidez, alerta e apetite se mostraram dentro da normalidade

6. Resultados e discussão

Análise da Contração da ferida

Ao analisar as fases da cicatrização, durante a fase inflamatória (1º ao 7º dia) a pomada veículo (G4) se mostrou mais eficiente, com o maior percentual de redução da ferida (134,4%), já na fase proliferativa (7º ao 14º dia) os grupos G1 e G3 também apresentaram aumento no percentual de contração, com resultados próximos ao da pomada veículo, mostrando-se também como eficazes na redução da área da ferida, embora sem apresentarem diferenças estatísticas significativas (P>0,05%).

6. Resultados e discussão

O tratamento com as pomadas contendo extrato de V. erythropappa Schultz – Bip não causou nenhuma alteração patológica nos animais, de forma que não promoveu desenvolvimento de infecção.

Não foi tóxico ao sistema renal e hepático, uma vez que os valores de ureia, creatinina, TGO e TGP também se mostraram satisfatórios, e não tóxicos quando comparados aos controles, sendo portanto, eficaz no tratamento de feridas cutâneas.

6. Resultados e discussão

Avaliação da Imunoistoquímica para VEGF

Figura 25 – Expressão imunoistoquímica do VEGF nas células teciduais de feridas tratadas, contendo o extrato de V. erythropappa Schultz – Bip nas concentrações 1% (G1), 3% (G2) e 5% (G3), com a pomada veículo (G4) e com a pomada Fitoscar® (G5). * Apresentaram diferença estatística significativa (P<0,05%) quando comparados com o grupo controle positivo (pomada veículo) e controle negativo (pomada Fitoscar®).

6. Resultados e discussão

Avaliação Qualitativa e Quantitativa do Colágeno (tipo I e tipo III)

Figura 26 – Fotomicrografia obtida sob microscopia de polarização com coloração Picrosirius e aumento de 400x, que mostra a distribuição das fibras de colágeno tipo I (vermelho) e III (verde) no tecido cicatricial da pele de ratos tratados com pomadas contendo extrato de V. erythropappa Schultz – Bip nas concentrações 1% (G1), 3% (G2), 5% (G3), pomada veículo (G4) e Pomada Fitoscar® (G5) nos dias sete, quatorze e vinte e um de pós operatório.

6. Resultados e discussão

Figura 27 – Percentual de colágeno tipo III (verde) encontrado nos grupos G1, G2, G3, G4 e G5, no sétimo dia de tratamento. 1 representa diferença significativa em relação ao grupo G1 (1%), 3 representa diferença significativa em relação ao grupo G2 (3%), 5 representa diferença significativa em relação ao grupo G3 (5%), C representa diferença significativa em relação ao grupo G4 (Veículo), F representa diferença significativa em relação ao grupo G5 (Fitoscar®).

Figura 28 – Percentual de colágeno tipo III (verde) encontrado nos grupos G1, G2, G3, G4 e G5, no décimo quarto dia de tratamento. 1 representa diferença significativa em relação ao grupo G1 (1%), 3 representa diferença significativa em relação ao grupo G2 (3%), 5 representa diferença significativa em relação ao grupo G3 (5%), C representa diferença significativa em relação ao grupo G4 (Veículo), F representa diferença significativa em relação ao grupo G5 (Fitoscar®).

6. Resultados e discussão

Figura 29 – Percentual de colágeno tipo III (verde) encontrado nos grupos G1, G2, G3, G4 e G5, no vigésimo primeiro dia de tratamento. 1 representa diferença significativa em relação ao grupo G1 (1%), 3 representa diferença significativa em relação ao grupo G2 (3%), 5 representa diferença significativa em relação ao grupo G3 (5%), C representa diferença significativa em relação ao grupo G4 (Veículo), F representa diferença significativa em relação ao grupo G5 (Fitoscar®).

Figura 30 – Percentual de colágeno tipo I (vermelho) encontrado nos grupos G1, G2, G3, G4 e G5, no sétimo dia de tratamento. 1 representa diferença significativa em relação ao grupo G1 (1%), 3 representa diferença significativa em relação ao grupo G2 (3%), 5 representa diferença significativa em relação ao grupo G3 (5%), C representa diferença significativa em relação ao grupo G4 (Veículo), F representa diferença significativa em relação ao grupo G5 (Fitoscar®).

6. Resultados e discussão

Figura 32 – Percentual de colágeno tipo I (vermelho) encontrado nos grupos G1, G2, G3, G4 e G5, no vigésimo primeiro dia de tratamento. 1 representa diferença significativa em relação ao grupo G1 (1%), 3 representa diferença significativa em relação ao grupo G2 (3%), 5 representa diferença significativa em relação ao grupo G3 (5%), C representa diferença significativa em relação ao grupo G4 (Veículo), F representa diferença significativa em relação ao grupo G5 (Fitoscar®).

Figura 31 – Percentual de colágeno tipo I (vermelho) encontrado nos grupos G1, G2, G3, G4 e G5, no décimo quarto dia de tratamento. 1 representa diferença significativa em relação ao grupo G1 (1%), 3 representa diferença significativa em relação ao grupo G2 (3%), 5 representa diferença significativa em relação ao grupo G3 (5%), C representa diferença significativa em relação ao grupo G4 (Veículo), F representa diferença significativa em relação ao grupo G5 (Fitoscar®).

6. Resultados e discussão

-Grupos controle (G4) e Fitoscar® (G5) tiveram maior quantidade de fibras do tipo III, consideradas imaturas.

-Grupos tratados com as pomadas contendo extrato 1% e 5% (G1 e G3, respectivamente) tiveram maior quantidade de fibras do tipo I, consideradas maduras, indicando que tais formulações foram efetivas para a cicatrização das feridas, com G3 apresentando o melhor resultado.

De maneira geral, essa análise indicou que a pomada foi eficaz em promover inicialmente formação de novo tecido sobre o leito da ferida (colágeno III ), o qual passou por maturação (colágeno I), tornando o tecido cicatricial mais forte e resistente.

7.Considerações Finais

- Os efeitos foram observados nas análises das feridas, nas quais as pomadas contendo o extrato hexânico de V. erythropappa Schultz – Bip (1%, 3% e 5%) promoveram cicatrização da ferida, mostrando ser eficaz na fase proliferativa da cicatrização, resultando em melhor índice de contração da ferida.

- As pomadas contendo o extrato hexânico apresentaram resposta mais efetiva ao tratamento, quando comparadas com o fitoterápico , o que indica a possibilidade do uso dessa planta como cicatrizante no tratamento de feridas, chamando atenção para seu possível uso como medicamento fitoterápico.

7. Considerações finais

No Brasil existem cinco indústrias de óleo de candeia natural bruto e três de alfabisabolol, o obtido a partir da destilação do óleo.

Segundo Silva et al. (2014) o plantio da Candeia em espaçamentos maiores – 1,5 x 3,0 m – é preferível por ser mais lucrativo e por apresentar menor risco de resultados desfavoráveis. Ainda, segundo os autores, a idade ótima de corte, sendo a melhor rotação econômica, é de 12 anos.