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PGLO 박테리아 형질전환
261
21012 엄장은
실험목적
pGLO
박테리아
형질전환
실험
1.형질전환 현상을 정의하고 설명할수 있다
2. 플라스미드가 들어간 대장균을 선별하는 방법을 설명할 수 있다.
3. 녹색 형광 단백질의 활용가능성과 중요성을 이해한다.
실험 기구 및 재료
실험기구
및 재료
재료
재료
1.대장균이 배양중인 고체 평판배지
2.고체 배지(LB배지, 항생제가 첨가된 LB배지,항생제와 아라비노스가 첨가된 LB배지)
3.형질전환용액 (50mM CaCl2)
4. 액체 LB배지
5. pGlo plasmid DNA 용액
6.파라필름
기구
기구
1. 백금이
2. 마이크로피펫
3. 마이크로튜브 홀더
4. 유성펜
5. 소형 얼음통
6.항온 수조
7.UV램프
8.파쇄된 얼음
9.진탕기
10.초시계
11.배양기(37℃)
이론적 배경
pGLO ㅅㄴㄴsystem
pGLO
system
대장균에 녹색형광 단백질을 삽입하여 형질전환을 이르키는 체계pGLO system 에는 GFP 유전자와 엠피실린이라는 항생제를 분해하는 효소를 만들어 항생제 저항성을 만드는 유전자(bla), GFP유전자의 전자를 조절하는 단백질을 만드는 (araC)를 포함하고 있다. GFP유전자의 전사를 조절하는 단백질을 만드는 유전자는 배지에 탄수화물의 한 종류인 아라비노스가 있으면 발현된다. 즉 형질 전환된 대장균은 아라비노스가 들어있지 않은 배지에서는 GFP가 발현되지 않은 흰색의 콜로니로 나타나고,아라비노스가 들어있는 배지에서는 GFP가 발현되어 UV를 쬐면 녹색형광을 나타낸다
2.녹색 형광 단백질 GFP
GFP
생물 발광체인 해파리가 만들어내는 물질로 어두운 곳에서 빛을 발하므로 형광을 띤다. 자외선 램프로 쉽게 세포내에서 발현되었는지를 조사할 수 있고 다른 합성 형광물질과는 달리 독성이 적어 살아있는 세포에서 활용 할 수 있다. 이런 특성으로 GFP 유전자를 연구하고자 하는 다른 유전자와 결합시켜 생명공학 연구에 아주 중요한 도구로 사용할 수 있다.
3.형질전환
형질전환
새로운 유전 정보를 가진 DNA조각을 세포에 집어넣고 발현시키는 것이다. 이 새로 들어간DNA로 인하여 개체는 새로운 특성을 갖게된다. 즉 유전자의 형질 전환은 개체의 특성을 바꾸기 위해 개체 안으로 하나 이상의 유전자가 삽입되어 나타나는 변화를 의미한다.
4.플라스미드
플라스미드
일부 세균에서 주염색체 이외에 별도로 존재하는 고리모양의 DNA, DNA 재조합에서 유전자 운반체 (vector) 로 이용된다.
특성:-복제원점이 있어 복제가 가능하다- 세균의 생존에 필수적이지 않으며, 세포내로 도입하기 쉽다.- 숙주세포내에 수가 많으며, 쉽게 분리 정제할 수 있다.
실험방법
마이크로 튜브 2개를 준비하여 유성펜으로 옆면에 각각 +pGLO와 -pGLO로 표시한다.
1.
마이크로 피펫으로 형질 전환 용액을 250씩 1.의 마이크로 튜브에 옮겨 넣는다
2.
형질전환 용액이 들어간 마이크로 튜브에 얼음을 꽂는다.
3.
배양중인 평판 배지에서 대장균 콜로니 하나를 멸균한 백금이로 덜어 +pGLO 튜브에 접종한다. 콜로니가 형질 전환 용액에 완전히 섞이도록 백금이를 회전시킨다. 이후 튜브를 다시 얼음에 꽂는다. -pGLO 튜브도 4. 와 같은 방법으로 접종하고 얼음에 꽂는다.
4.
멸균한 백금이를 플라스미드 용액이 들어있는 병에 담갔다 빼서 +pGLO 튜브에 넣고 잘 섞은 후 튜브를 다시 얼음에 꽂는다. -pGLO 튜브에는 플라스미드를 넣지 않는다.
5
얼음에서 10분간 둔다.
6
얼음에 있던 2개의 마이크로 튜브를 42도 로 맞줘친 항온수조로 옮겨 50초 동안 띄어 놓는다. 마이크로튜브의 형질 전환 용액 부분이 물에 확실히 잠겨있어야한다. 50초 후 다시 마이크로 튜브를 얼음에 재빨리 꽂고. 2분간 더 둔다.
7
튜브에 LB배지를 250씩 넣고 뚜껑을 닫는다. 이후 마이크로 튜브 홀더에 놓고 상온에서 10분간 둔다.
8
마이크로 튜브의 하단 부위를 손끝으로 살살쳐서 내부의 용액이 서로 잘 섞이게 한다. 100씩 각 마이크로 튜브로부터 덜어 준비한 4종의 고체 배지에 떨어뜨린 후 백금이로 배지 표면에 고르게 펴준다.
9
배지의 뚜겅을 닫고 파라필름으로 밀봉한 후 뒤집어 함께 테이프로 묶는다, 상단에 실험자의 이름. 실험한 날짜를 적는다. 섭씨 37 배양기에 넣고 하루 정도 배양한다.
10
11
colony가 보이면 UV램프로 비추어 형광 유무를 확인한다.
고찰
https://www.youtube.com/watch?v=0wcRFRfujlo
ㅅㄱTransformation efficiency
1.
-10μL plasmid 용액에 plasmid DNA 양은 얼마인가?
-Fraction of DNA 는 얼마인가?
-배지에 spread 된 plasmid DNA양은 얼마인가?
-Transformation efficiency는 얼마인가?
example
2. 형질전환 용액 CaCl2 를 사용하는 이유
2.
정상적인 박테리아 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 있도록 해주는 세포를 만들기 위함이다.
-DNA 는 인산기가 있어 (-) 전하를 띠고, 세포막은 디아실그리세롤에 의해 (-)전 하를 띄기 때문에 DNA와 세포막 사이에는 척력이 발생하게 되는데 Ca2+ 가 이를 중화시켜준다. 그러면서 세포막 고유 전하가 변하게 되고 막 구조에 불안정을 야기하면서 흐물흐물해진다.
3. heat shock 를 하는 이유
3.
대장균 세포막 내외의 열적 불균형이 생겨 세포막의 유연성을 떨어지게 하여 그 때 생기는 틈새로 외부 DNA가 세포 내부로 들어가게 된다.