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Proteínas
AMINOÁCIDOS
GRUPO AMINO
+
GRUPO ÁCIDO
El término aminoácido podría significar cualquier molécula que contenga un grupo amino y cualquier tipo de grupo ácido; sin embargo, el término casi siempre se usa para referirse a un ácido carboxílico a-amino.
AMINOÁCIDOS
L- alminoácidos
Debido a que su estructura es similar a la de un L - gliceraldehido con el grupo amino a la izquierda de en la proyección de Fischer, reciben en nombre de L – aminoácidos.
L-aminoácidos?
20 AMINOÁCIDOS ESTANDARES
CLASIFICACIÓN
Según el grupo R que contenga el aminoácido
Siguiente
> No polares cuando la cadena lateral contiene un H o un grupo alquilo
> Su cadena tiene un grupo OH
> La cadena lateral contiene azufre
> La cadena lateral contiene nitrógeno no básico
> La cadena lateral es básica
Según su carácter en :
ÁCIDO
NEUTRO
BÁSICO
>> Aminoácido con carga (+) en disolución ácida; pH bajo
Otra clasificación
>> Aminoácido esté balanceado de igual manera entre las dos formas, como el zwitterion dipolar con una carga neta de cero. pH isoeléctrico
>> Aminoácido con carga (-)en una disolución básica; pH alto.
Los 9 esenciales
Aminoácidos esenciales
-Regula los niveles de azúcar en sangre
-Promueve la cicatrización de heridas
-Forma parte de la hemoglobina
Descripción
-Formación de hemoglobina
-Reparación de tejido muscular
-Favorece la absorción de calcio
-Indispensable para el crecimiento corporal
-Fuente de azufre
-Actúa en el metabolismo de las grasas
-Metabolismo muscular
-Equilibrio de nitrógeno
Y también
-Importante para la salud del sistema nervioso
-Producción de colágeno
Triptófano
-Proporciona el correcto funcionamiento y desarrollo neuronal
- Síntesis de hormonas
-Síntesis de hormonas de bienestar emocional
Base conjugada
Ácido
Henderson-Hasselbach
Aplicación de la ecuación de Henderson-Hasselbach
Ejemplo
Aminación reductiva
SÍNTESIS
DE
AMINOÁCIDOS
Síntesis
de
aminoácidos
Aminación reductiva de alfa-cetoácido
-Llamada también síntesis biomimética
¿Cómo se logra? tratando el alfa-cetoácido con:
-Amoníaco (NH3)
-Hidrógeno
-Catalizador de paladio
Síntesis de fenilalanina racémica a partir del ácido 3-fenil-2-oxopropanoico
Ejemplo
Llamada así debido a que "imita el procesos biológico"
Se asemeja a la síntesis biológica de los aminoácidos
¿Biomimética?
AMINACION DE UN ALFA-HALOÁCIDO
-Ecuación representativa
Aminación de un alfa-haloácido
-Se lleva a cabo por medio de la aminación directa
-Exceso de amoníaco
SÍNTESIS DE STRECKER
> Fue la primera síntesis conocida de un aminoácido
que se puedo realizar.
> El primer producto fue alanina racémica
Strecker
Adolph Strecker
(1822-1871)
MECANISMO
DE
REACCIÓN
> Un aldehído reacciona con amoniaco para formar una imina.
> En una reacción de adición con el ion cianuro se forma un compuesto intermediario, un aminonitrilo
> Se hidroliza el aminonitrilo y se forma el aminoácido
SINTESIS DE GABRIEL- ESTER MALÓNICO
> También llamada síntesis del éster N-ftalimidomalónico
> Combinación de la síntesis de aminas de Gabriel y la síntesis con el éster malónico de ácidos carboxílicos
> Buen rendimiento
Garbiel-
ester malónico
a
> Un protón se elimina con facilidad del carbono del éster
N-ftalimidomalónico
> El carbanión que resulta reacciona con un haluro de alquilo a través de una reacción SN2
> Al calentar en disolución acuosa ácida se hidrolizan los dos grupos éster y los dos grupos amida, y se descarboxila el ácido
3-oxocarboxílico.
MECANISMO
DE
REACCIÓN
RACEMIZACIÓN
> En la naturaleza sólo se sintetizan los L-aminoácidos
> En el laboratorio las síntesis nos dan como producto una MEZCLA RACÉMICA de enantiómeros D y L
Racemización
RESOLUCIÓN CINÉTICA
Resolución cinética
> Separación de enantiómero de la mezcla racémica
> Reacción catalizada por una enzima
> Las enzimas son quirales, reaccionan con una rapidez distinta con cada uno de los enantiómeros.
> La separación de los enantiómeros depende de la diferencia en la rapidez de la reacción de la enzima con los compuestos
SÍNTESIS ENANTIOSELECTIVA
> Preparar únicamente el enantiómero deseado
> Los L-aminoácidos pueden prepararse enantioselectivamente por hidrogenación de un ácido
(Z)-enamido con un catalizador de hidrogenación quiral
Sintesís
enantioselectiva
Por su descubrimiento, Knowles compartió el Premio Nobel de Química en 2001
PROPIEDADES FÍSICAS DE LOS AMINOÁCIDOS
PROPIEDADES
FÍSICAS
DE LOS
AMINOÁCIDOS
PUNTO ISOELÉCTRICO (pI)
> El punto isoeléctrico (pI) de un aminoácido es el pH al cual no tiene carga neta
> El pI de cualquier aminoácido es el promedio de las dos constantes ácidas de disociación (pKa) que involucran al ion dipolar neutro
> Para los aminoácidos con una cadena lateral neutra, el pI es el promedio de pKa1 y pKa2.
> Para los aminoácidos con una cadena lateral ácida, el pI es el promedio de los dos valores más bajos de pKa.
> Para los aminoácidos con una cadena lateral básica, el pI es el promedio de los valores más altos de pKa
Punto
isoeléctrico
Aminoácido básico
Aminoácido ácido
Aminoácido neutro
(Lisina)
Cálculos
(Ácido aspártico)
(Alanina)
pI
de los
aminoácidos
Propiedades ácido-base
Propiedades
acido-base
-Todo aminoácido tiene un grupo carboxilo y uno amino, cada uno puede existir en forma de ácido o base
- No puede existir como un compuesto sin carga
Aunque normalmente se los escribe como
-COOH y -NH2, su estructura real es iónica y depende del pH
ION ZWITTERION
-Esta formado por un ion carboxilato y un ion amonio
Ion dipolar
Esta naturaleza dipolar le proporciona propiedades poco usuales
-Puntos de fusion altos (200°C)
- Aminoacidos son mas solubles en agua que en etér, diclorometano y otros disolventes organicos
- Los aminoacidos tienen momentos dipolares mayores que las aminas o los ácidos sencillos
-Los aminoacidos son menos acidos que la mayoria de los acidos carboxilicos y menos basicos que la mayoria de las aminas
- La parte acida es -NH3+ y la basica -COO-
Propiedades
Son anfotericos
Lo que significa que tiene propiedades acidas y basicas
En una solucion con pH ácido el
-COO- se protona a un grupo -COOH libre y la molecula tiene carga positiva total
A medida que se aumenta el pH el carboxilo pierde el proton en pH2, a este punto se le conoce como pKa1 . Al aumentar aun mas, a pH 9 o 10 el grupo amino pierde otro proton , a este punto se lo llama pkb2
Propiedades quimicas
Descarboxilación
Al igual que los ácidos carboxílicos monofuncionales, los aminoácidos se esterifican cuando se tratan con un gran exceso de alcohol y un catalizador ácido. En estas condiciones ácidas, el grupo amino está presente en su forma protonada por lo que no interfiere con la esterificación
Los ésteres de aminoácidos se usan con frecuencia como derivados protegidos para evitar que el grupo carboxilo reaccione de alguna manera no deseada. Los ésteres metílicos, etílicos y bencílicos son los grupos protectores más comunes. El ácido acuoso hidroliza al éster y regenera el aminoácido libre
siguiente
Los ésteres bencílicos son muy útiles como grupos protectores debido a que pueden ser eliminados por medio de una hidrólisis ácida o por medio de una hidrogenolisis neutra. La hidrogenación catalítica rompe al éster bencílico, convirtiendo el grupo bencilo a tolueno y dejando el aminoácido desprotegido. Aunque el mecanismo de esta hidrogenolisis no es bien conocido, aparentemente se basa en la facilidad de la formación de intermediarios bencílicos
Acilación del grupo amino:
formación de amidas.
Así como un alcohol esterifica al grupo carboxilo de un aminoácido, un agente acilante convierte al grupo amino en una amida. La acilación del grupo amino con frecuencia se realiza para protegerlo de reacciones nucleofílicas no deseadas. Para la acilación se usa una amplia variedad de cloruros ácidos y anhídridos. EL cloroformo de bencilo acila el grupo amino para formar un derivado de benciloxicarbonilo, con frecuencia usado como grupo protector en la sintesis de peptidos.
El grupo amino del derivado de N-benciloxicarbonilo está protegido como la mitad de amida de un éster de carbonato, la cual se hidroliza con mayor facilidad que la mayoría de las demás amidas. Además, la mitad de este uretano es un éster bencílico que experimenta hidrogenólisis, ésta es catalítica del aminoácido de N-bencilozicarbonilo forma un ácido carbámico inestable que se descarboxila rápidamente para formar el aminoácido protegido.
REACCIONES DE CARACTERIZACIÓN
Reacción de la ninhidrina
Obtenemos como producto al púrpura de Ruhemann.
Espectrómetro
Dato!
La ninhidrina puede detectar aminoácidos en una amplia variedad de sustratos. Por lo que es utilizada en criminología para la detección de huellas digitales
Método de Sanger
Determinacion del N-terminal
Extremo de una proteína que finaliza con un aminoácido que posee un grupo amino libre.
¿QUÉ SON LOS PÉPTIDOS?
Compuestos formados por dos o más aminoácidos
PÉPTIDOS
Siguiente
Nomenclatura
Se agrega la terminación "il"
Si se conocen los aminoácidos presentes...
Pero su secuencia no
Y también su secuencia
Se utilizan las comas
Se utilizan los guiones
Enlace peptídico
-Enlace covalente entre -NH2 y -COOH de dos aa distintos.
-Los péptidos están formados por la unión de aa mediante enclaces peptídicos
-El enlace peptidico se representa normalmente como un enlace sencillo aunque algunas caract. se aproximan a las de un doble enlace.-
-El impedimento esterico en la configuración cis hace que la configuración trans sea mas estable con respecto al enlace de amida y entonces los carbonos a de los aminoácidos adyacentes son trans entre sí.
-Normalmente la config, trans es la favorecida
aunque hay un caso en la que es favorecida la cis
El carácter parcial de enlace doble evita la rotación libre en torno al enlace petídico y de esa manera los átomos de carbono y nitrógeno del enlace peptidico y los dos átomos a los que está unido cada uno se mantienen rígidamente en un plano.
La resonancia incrementa la polaridad del enlace peptidico y se establece un momento dipolar, por lo que cada enlace peptidico puede participar en dos enlaces hidrogeno, donde -NH- actua como donador y -CO- como receptor
péptidos importantes
oxitosina - bradiquinina - glutatión - vasopresina - insulina - tirotropina
Vasopresina
controla la presión sanguínea regulando la contracción de los músculos lisos; tambien es antidiurética.
Glutatión
destruye los agentes oxidantes perjudiciales para el organismo,
los cuales pueden causar algunos de los efectos del envejecimiento y
están asociados con
la generación del
cáncer
Oxitosina
induce el parto en mujeres embarazadas estimulando la concentración del músculo uterino y también estimula la produccion de leche en madres lactantes
Insulina
controla la concentración de la glucosa en la sangre regulando el metabolismo de la glucosa.
Síntesis de péptidos en solución
Síntesis de un tetrapéptido llamado: ABCD
Rendimiento por etapa de purificación 80%
Condensación fragmentada
Elongación gradual
Rendimiento del 64%
Rendimiento del 52,1%
GRUPOS PROTECTORES
Se protegen para evitar la formación de enlaces peptídicos no deseados
CLASIFICACIÓN
• Permanentes: son retenidos hasta que el péptido ha sido completado
• Temporales: se eliminan al final de cada etapa de síntesis
CARACTERÍSTICAS
• Ser químicamente estable en las condiciones que se dé la síntesis peptídica
• Ser fácilmente removibles en condiciones suaves que no alteren la formación del enlace peptídico al final o en fases intermediarias de la síntesis
Grupo protector del alfa-amino
INCONVENIENTES
OBJETIVO
>> Suprimir la reactividad nucleofilica del grupo amino
a) Encontrar un grupo protector que pueda ser removido con facilidad y sin afectar la integridad del enlace peptídico formado
b) Evitar que el carbono alfa corra riesgo de racemización
Derivados de uretano adecuados para la protección del αALFA-amino
Alto grado de estabilidad óptica
Derivados del Uretano más usados
- Benciloxicabonil
- T- Butoxicarbonil (Boc)
- 2-(4-bifenilil)-isopropoxicarbonil (Bpoc)
- Fluorenil-9-metoxicarbonil (Fmoc)
NO derivados del Uretano
--> Trifenilmetil (trityl, Trt)
--> 2-Nitrofenilsulfonil (Nps)
--> Ditiosuccinil
Grupos protectores del alfa-carboxilo
¿Por qué protegerlo?
Métodos más comunes
>esterificación<
>> Aumentar la solubilidad del péptido
>>Bloquear el grupo carboxilo que no formara parte del enlace peptídico
>>Metil éster y etil éster
>> Bencil éster
>> t-Butil éster
>> Fenil éster
Protección de las cadenas laterales
>> Las cadenas laterales le confieren propiedades únicas a cada aminoácido
LISINA: ya que el grupo e-amino es más básico y nucleofílico que el grupo a-amino
ARGININA: puede presentar problemas de solubilidad
ÁCIDOS GLUTÁMICO Y ASPÁRTICO: ya que sino interferfieren en la formación del enlace peptídico
TRIPTÓFANO: ya que es capaz de atrapar reactivos electrofílicos
CISTEÍNA: para guiar la formación del puente disulfuro
SERINA, TREONINA Y TIROSINA: ya que son capaces de reacionar con reactivos acilados
HISTIDINA: el anillo imidazol es capaz de intercambiar grupos acilo de formas no deseadas
Activación y acoplamiento
>>El grupo carboxilo debe ser activado si se busca la formación de una amida
Métodos:
-Cloruros y fluoruros de acilo
-Acil azidas
-Anhídridos
-Ésteres activados
-Carbodiimidas
-Sales de fosfonio
DETERMINACIÓN DE PÉPTIDOS
REACTIVO
DE
SANGER
DEGRADACIÓN
DE
EDMAN
REACTIVO DE SANGER
> 1-Fluor-2,4-dinitrobenceno. Se abrevia como FDNB
> Reactivo clave en el método de Sanger para identificar el
extremo N-terminal en una cadena polipeptídica.
> Reacciona con el amino del aminoácido N-terminal.
> Da dinitrofenil derivado (DNP) de color amarillo.
> Los DNP derivados se pueden separar e identificar por cromatografía
Se Ie conoce como reactivo de Sanger, en honor de Frederick Sanger, quien lo utilizó para determinar la secuencia de aminoácidos de la insulina, la primera proteína en ser analizada de esta manera.
DEGRADACIÓN DE EDMAN
> Para conocer en qué orden están unidos los aminoácidos
> Consiste en romper un aminoácido a la vez desde un extremo de la cadena peptídica.
> El aminoácido terminal se separa e identifica y se repiten las reacciones de ruptura en el péptido de cadena acortada hasta que se conoce por completo la secuencia del péptido.
> Los péptidos de cadena acortada se vuelven a someter de forma automática a otro ciclo de degradación de Edman.
> No es práctica la secuenciación completa de proteínas largas por la degradación de Edman debido a la acumulación de subproductos no deseados.
solución
- Se rompe la cadena de péptidos por hidrólisis parcial en un número de fragmentos más pequeños
- Se determina la secuencia de cada fragmento.
- Se han secuenciado cadenas de proteínas con más de 400 aminoácidos.
DEGRADACIÓN DE EDMAN
ETAPA 3
la tiazolinona se isomeriza a la feniltiohidantoína más estable.
ETAPA 2
la feniltiourea se cicla para formar una tiazolinona y se libera la cadena de péptido acortada
ETAPA 1
el grupo amino libre del aminoácido
N-terminal reacciona con el isotiocianato de fenilo para formar una feniltiourea
PROTEÍNAS
Polímeros de aminoácidos en los que los aminoácidos individuales, llamados residuos, están unidos por enlaces amida o enlaces peptídicos
PROTEÍNAS
CLASIFICACIÓN
Segun su composición química
CLASIFICACIÓN
CONJUGADAS
SENCILLAS
- Se hidrolizan para formar sólo aminoácidos.
Ejemplos
- Están unidas a un grupo prostético no proteínico como un azúcar, un ácido nucleico, un lípido o algún otro grupo.
Ejemplos
OXITOCINA
INSULINA
HEMOGLOBINA
GAMMA GLOBULINA
RIBONUCLEASA
CLASIFICACIÓN
Según su forma
GLOBULARES
FIBROSAS
Otra clasificación...
- Se pliegan en formas aproximadamente esféricas
- Solubles en agua
- Funcionan como enzimas, hormonas o proteínas transportadoras.
- Cadena de polipeptidos arregladas lado a lado en filamentos largos.
- Insolubles en agua
- Función estructural
Niveles estructurales de las proteínas
Estructura
Agentes desnaturalizantes
Desnaturalización
Físicos
Calor
Químicos
Pérdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria)
Fuerza iónica
Desnaturalización
pH
Detergentes
Disolventes orgánicos
La desnaturalización provoca diversos efectos en las proteínas:
- Pérdida de propiedades biológicas
-cambios en las propiedades hidrodinámicas
-Disminuye la solubilidad
Propiedades funcionales con ácido nitroso
El ácido nitroso reacciona con el grupo amino de los aminoacidos formando los ácidos hidroxilados correspondientes, liberando nitrógeno gaseoso.
Propiedades funcionales
Esta es la reacción que se utiliza para determinar el nitrógeno del grupo amino, se conoce como procedimiento de Von Slyke y sirve para estimar los grupos aminos libres de los péptidos y las proteínas midiendo la cantidad de nitrógeno liberado.
Acción del anhídrido acético
Así como un alcohol esterifica el grupo carboxilo de un aminoácido, un agente acilante convierte al grupo amino en una amida. La acilación del grupo amino con frecuencia se realiza para protegerlo de reacciones nucleofílicas no deseadas. Para la acilación se usa una amplia variedad de cloruros de ácido y anhídridos.
La histamina se sintetiza en el cuerpo por medio de la descarboxilación de la histidina.
A la enzima que cataliza esta reacción se le llama histidina descarboxilasa
Método de fraccionamiento de las proteínas
Centrifugación
Se trata del método más sencillo para concentrar proteínas, pudiendo utilizarse para separar subestructuras celulares (en el caso de que la proteína de interés esté localmente concentrada), o para fraccionar una muestra de proteínas compleja, en función de su coeficiente de sedimentación.
Hay 2 tipos de rotores
Basculante
Angular o fijo
Hay 3 tipos de centrifugación
Precipitación
Precipitación
Precipitación con sales neutras
Inmunoprecipitación
Precipitación isoléctrica
Diálisis
Diálisis
Electroforesis
Usa las diferencias en los puntos isoeléctricos para separar mezclas de aminoácidos
Electroforesis
Fuerza de fricción
Difusión
EJEMPLO:
Alanina, Lisina y Ácido aspártico en una disolución reguladora a un pH de 6
EJEMPLO
> La alanina está en su punto isoeléctrico, en su forma zwitteriónica dipolar con una carga neta de cero.
> La Lisina tiene un pH isoeléctrico de 9.7, por lo que la lisina está en la forma catiónica.
> El ácido aspártico tiene un pH isoeléctrico de 2.8, por lo que está en la forma aniónica.
> Se aplica un voltaje:
-La Alanina no se mueve
-La Lisina se mueve hacia el cátodo con carga negativa
-El Ácido aspártico se mueve hacia el ánodo con carga positiva
> Se recuperan los aminoácidos separados
> Se identifican los aminoácidos comparando la posición
Siguiente
CROMATOGRAFÍA
> Método físico que permite separar los componentes de una muestra.
> Los componentes de una mezcla se distribuyen entre dos fases
> Fase estacionaria: sólido o líquido fijado a un sólido
> Fase móvil: fluído que arrastra a la muestra a través de
la fase estacionaria.
Cromatografía
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIOS IÓNICOS (IEC)
> La separación se basa en diferencias de carga a un pH dado
> Dos tipos:
-Intercambio aniónico para proteínas ácidas
-Intercambio catiónico para proteínas básicas
> Los aminoácidos separados salen (eluyen) del extremo de la columna cromatografíca mezclados con una disolución de ninhidrina
> El color es detectado por un espectrómetro, y se obtiene una gráfica de tiempo de elución
Tipos
CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA (RPC)
> La fase móvil es ligeramente más polar que
la estacionaria
> Las proteínas hidrofóbicas de la fase móvil
se adsorberán a la fase estacionaria
> Las proteínas hidrofílicas serán eluídas.
> Capaz de separar componentes
con características muy similares
otro
tipo
> Se basa en una interacción biológica específica:
°Proteína-ligando específico
> En general se trata de análogos a ligandos que naturalmente interaccionan con la proteína
> Ventajas:
-Especificidad
-Pureza del producto final
-Se evitan otros pasos de purificación
-Altos rendimientos
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
Otro
tipo
> Se basa en una interacción biológica específica: Proteína-ligando específico
> En general se trata de análogos a ligandos que naturalmente interaccionan con la proteína
> Ventajas:
-Especificidad
-Pureza del producto final
-Se evitan otros pasos de purificación
-Altos rendimientos
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD SOBRE METALES INMOVILIZADOS
> Se basa en la formación de enlaces de coordinación entre iones metálicos inmovilizados y grupos básicos en proteínas
> Técnica muy utilizada para la concentración de proteínas fosforiladas.
otro tipo
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
> Separar las proteínas de una muestra en función de su masa molecular
> Las proteínas mas pequeñas pueden entrar por difusión simple en las partículas en la fase estacionaria, por lo que son retenidas más tiempo y salen más tarde en una cromatografía.
otro tipo
SI ALGUIEN PREGUNTA ALGO.
HAY TABLA