DNA BİYOSENSÖRLERİ

İÇERİK

DNA Yapısı ve Özellikleri

DNA Biyosensörleri

Elektrokimyasal DNA Sensörleri

Elektrokimyasal DNA biyosensöründe Dizi Algılama Yöntemi

DNA-madde Etkileşimine Dayalı Elektrokimyasal Sensörler

Piezoelektrik DNA Sensörleri

Kaynaklar

DNA YAPISI VE ÖZELLİKLERİ

DNA, canlıların genetik şifresini taşıyan büyük bir moleküldür.DNA nükleotit adı verilen birimlerden oluşmaktadır. Her nükleotit deoksiriboz şekeri, fosfat ve bir bazdan oluşur.

DNA’da bulunan bazlar adenin, guanin, sitozin ve timindir. Ayrıca bu bazlar kimyasal yapısına göre adenin (A) ve guanin (G) içeren pürinler ile timin (T) ve sitozin (C) içeren pirimidinler olarak sınıflandırılabilir.

Watson, Crick ve Wilkins tarafından 1950 yıllarında DNA yapısı için çift zincirli heliks şeklindeki yapı modeli önerilmiştir. Bazları arasında yer alan hidrojen bağları tarafından çift sarmal DNA molekülünün iki zinciri birarada tutulmaktadır.

DNA bazlarının elektrokimyasal özellikleri

DNA’daki deoksiriboz ve fosfat grubu elektroaktif değildir. Nükleik asit bileşenlerinde sadece DNA bazları elektroaktiftir

Pürin (Adenin, Guanin) ve pirimidin (Sitozin, Timin) bazları birbirine hidrojen bağlarıyla bağlıdır. Adenin ve timin arasında ikili, Guanin ve sitozin arasında üçlü hidrojen bağı vardır.

DNA’daki guanin, adenin, sitozin ve timin bazları uygun pH’larda yükseltgenebilirler

DNA’nın tek (ssDNA) veya çift iplikçik (dsDNA) olmasına göre farklı elektrokimyasal davranışlar gösterdiği belirtilmiştir.

Pürin ve pirimidin nükleotidleri arasındaki eşleşmeler son derece spesifiktir (A-T ve G-C şeklinde).

Bu sayede, DNA yapısında yer alan bir polinükleotid zinciri daima ikinci zincirin tamamlayıcısı olduğundan, bir zincirdeki baz dizisi verildiğinde,ikinci zincirdeki baz dizisi bulunabilmektedir.

DNA BİYOSENSÖRLERİ

DNA biyosensörlerinde kullanılan bazı terimler

Oligonükleotit: Birden fazla bazın bir araya gelmesi ile oluşan yapıdır.

Baz çifti (bp): Birbirinin karşılığı olan iki bazı ifade eder ve gösterilirken nokta ile ayrılır. Örnek olarak, A.T ya da G.C baz çiftleri verilebilir.

Prob: Baz dizisi belli olan oligonükleotide denir.

Hedef dizi (target): Prob dizisinin karşılığını içeren oligonükleotit dizisidir.

Yanlış eşleşen dizi (mismatch): Bir ya da birden fazla bazı hedef diziden farklı olan ve dolayısıyla yanlış eşleşen oligonükleotit dizisidir.

Rastgele dizi (non complementary): Hedef diziden tamamen farklı baz dizilimine sahip oligonükleotit dizisidir.

DNA hibritleşmesi; birbirine eşlenik iki adet tek sarmal nükleik asit dizisinin çift sarmallı tek bir yapı haline gelmesi işlemidir.

Yapay olarak çoğaltılmış ve DNA probları olarak hazırlanmış olan spesifik DNA fragmentlerinin, niteliği araştırılacak olan hedef DNA molekülü ile birleştirilmesi işlemine hibridizasyon denir.

Tanıma yüzeyi olarak DNA’nın kullanıldığı biyosensörlere DNA biyosensörleri adı verilir. Biyosensörün, biyokimyasal kısmını oluşturan biyolojik materyel DNA olduğunda, DNA biyosensörü adını alır.

DNA tanıma yüzeyleri, dizisi belli hibridizasyon olaylarının izlenmesinde veya bu yüzey ile etkileşime giren

analizlenecek maddelerin (kanserojen madeler, ilaçlar, vb.) tayininde

kullanılabilir.

Bu hibridizasyonla oluşan çift zincirli DNA sayesinde bir elektrokimyasal ya da optik sinyal oluşur ve optik, piyezoelektrik, elektrokimyasal bir transduser ile sinyal okunabilir hale getirilir. Kullanılan DNA probları genellikle 20-30 bazlık kısa tek zincirli DNA’lardır.

ELEKTROKİMYASAL DNA SENSÖRLERİ

Elektrokimyasal DNA biyosensörleri, tanıma yüzeyi olarak nükleik asitlerle elektrokimyasal çeviricilerin birleştirilmesi sonucu elde edilmektedir.

Tipik bir elektrokimyasal DNA biyosensöründe, hedef dizi ile eşleşecek olan prob dizi tanıma yüzeyine immobilize edilir. Hedef DNA tanıma yüzeyinde yakalanır ve elde edilen hibridizasyon sinyali analiz için kullanılabilir bir elektronik sinyale çevrilir (Şekil 2.2). Elektrokimyasal biyosensörlerde gelen sinyal, elektronik olduğu için çevirme işlemi kolay bir şekilde yapılmaktadır

Elektrokimyasal DNA biyosensörünün tasarımı

DNA problarının elektrot yüzeyine immobizasyonu

Dna biyosensörlerinde 18-40 bazlık kısa oligonükleotit dizileri prob olarak kullanılmaktadır. Prob dizi elektrot yüzeyine güçlü ve düzenli şekilde bağlandığında, hibridizasyon tayini daha kolay gerçekleşecektir ve oluşan hibritin çeşitli fiziksel ve kimyasal etkenlerden etkilenip yüzeyden kopması gibi olumsuz etkiler de nispeten ortadan kalkacaktır. Kullanılan tekniğe göre elektrot yüzeyinde yatay veya düşey olarak tutturulmuş DNA tanıma katmanı elde edilmektedir.

Elektrot yüzeyine DNA bağlama(modifikasyon,immobilizasyon) teknikleri:

Pasif Adsorbsiyon Yoluyla Prob Tutturulması (ıslak adsorbsiyon yöntemi):

Yöntemin ilkesi şudur; prob içeren analiz çözelti içerisine kullanılan elektrodun daldırılarak probun elektrot yüzeyine adsorbe olmasıdır. Bu yöntemin basit ve otomasyona uygulanabilirliği kolaydır. Pahalı kimyasal madde kullanımı ve elektrokimyasal potansiyel uygulama basamaklarının ortadan kaldırılması nedeniyle ucuzdur ve tayin süresi de kısalmaktadır

Elektrostatik yolla prob tutturulması;

Elektrot yüzeyine pozitif (+) potansiyel uygulanarak, negatif (-) yüklü fosfat omurgasına sahip olan DNA’nın elektriksel çekim kuvvetleri sayesinde, elektrot yüzeyine paralel olarak tutunması ilkesine dayanır. Pahalı kimyasal maddeler kullanılmaması nedeniyle maliyeti düşük bir yöntemdir.

Kovalent yolla prob tutturulması;

Prob dizilerinin elektrot yüzeyine kovalent bağlanma ajanları kullanılarak, kovalent olarak tutturulması ilkesine dayanır. Bu şekilde yapılan tutturma işlemi ile elektrot yüzeyinde daha düzenli ve daha dayanıklı bir prob tabakası oluşmaktadır, bu da hibridizasyon tayininde çok önemli bir rol oynamaktadır. Ancak pahalı kimyasal maddeler kullanılması ve diğer yöntemlere oranla daha uzun bir işlem olması gibi dezavantajları bulunmaktadır.

Kendiliğinden düzenlenen tabakalar (SAM)

Tiyol (-SH) grubu ile işaretli oligonükleotitlerin altın elektrot yüzeyine afinitesi nedeniyle immobilize olmasıdır. Bu işlemde ayrıca yüzey merkaptoheksanol ile muamele edilerek spesifik olmayan bağlanmalar azaltılabilir.

Altın elektrot yüzeyine prob DNA immobilizasyonu,

A) Spesifik olmayan bağlanmalar,

B) Merkaptoheksanol ile muamele sonucu spesifik olmayan bağlanmaların azalması

Avidin veya streptavidin-biyotin kompleksi DNA biyosensörlerinde yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Avidin ve streptavidin tetramerik bir proteindir. Biyotin ise küçük bir moleküldür ve avidin veya streptavidine bağlanma afinitesi çok yüksektir. Hatta bilinen en güçlü kovalent olmayan bağlardan biridir. Kompleks, bu güçlü bağlanmadan dolayı aşırı pH veya sıcaklıktan, organik çözücülerden ve denatüre edici ajanlardan etkilenmemektedir

Avidin biyotin etkileşimi ile DNA immobilizasyonu

Bu işlemde önce yüzeyler avidin içeren çözeltiye daldırılır ve avidinin yüzeye kaplanması sağlanır. Sonra biyotin işaretli prob DNA çözeltisine daldırılarak immobilizasyon gerçekleştirilir (Şekil). Bu yöntemin dezavantajı elektrot yüzeyinde büyük bir proteinin olması spesifik olmayan bağlanmaları arttırabilir

Elektrokimyasal DNA biyosensörlerinde dizi algılama yöntemleri

Elektrokimyasal DNA biyosensörlerinde dizi algılama yöntemleri temel olarak ssDNA veya dsDNA’nın (işaretlemeli veya işaretsiz) elektrokimyasal davranışlarındaki farklılıklardan yararlanılarak yapılmaktadır.

DNA hibridizasyonunun işaretlemeye dayalı yöntemlerle belirlenmesi

Hibridizasyonun belirlenmesinde redoks aktif moleküller

Bu yöntemde, hibrit DNA elektrot, redoks aktif molekülü içeren çözeltide bekletilir ve DNA-molekül bağlanması gerçekleşir. DNA ve molekül etkileşiminden bir süre sonra yüzeyde biriken moleküller elektrokimyasal bir yöntemle tespit edilir. Eğer redoks aktif molekül daunomisin gibi bir interkalatör madde ise dsDNA’nın çift zinciri arasında birikecektir ve elde edilen redoks sinyali ssDNA’ya göre artacaktır

Hibridizasyon belirlenmesinde enzimle işaretleme

Enzim işaretli prob DNA’lar hibridizasyonun belirlenmesinde başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Bu amaçla önce yüzeye hedef DNA immobilize edilir. Daha sonra enzimle işaretlenmiş prob DNA ile hibridizasyon gerçekleştirilir. Ortama substrat eklendiği zaman ürününün elektrokimyasal aktivitesindeki artıştan yararlanılır.

İşaretsiz DNA dizi algılama yöntemleri

Diğer bir tayin yöntemi ise EVET/HAYIR sistemi adı verilen ve ssDNA (prob) dizisinde bulunan guanin bazları yerine inozinlerin kullanılmasıdır.

İnozin guanine yapıca benzemesine ve sitozinle ikili bağ oluşturmasına rağmen herhangi bir yükseltgenme sinyali vermemektedir. Bu nedenle elektrot yüzeyinde ssDNA dizisi varken herhangi bir yükseltgenme sinyali alınmazken, hibridizasyondan sonra hedef diziden gelen guaninlerden dolayı bir yükseltgenme sinyali gözlenir.

Guanin ve adenin karbon elektrot yüzeyinde kolaylıkla yükseltgenebilirler. Guanin asetat tamponunda (pH: 4,8) yükseltgenme sinyali +1,0 V civarındayken adenin sinyali ise +1,3 V civarındadır. Elektrot yüzeyine tutturulan ssDNA dizisindeki guaninler ve adeninler açık olduğu için yükseltgenme sinyali fazla iken, hibridizasyondan sonra ise sırasıyla sitozin ve timinle aralarında oluşturdukları hidrojen bağları nedeniyle yükseltgenmesi kısmen kapalı duruma gelir ve bu nedenle ssDNA’ya göre daha düşük sinyal oluşur

DNA-Madde Etkileşimine Dayalı Elektrokimyasal Biyosensörler:

İlaç -DNA Etkileşmesinin Elektrokimyasal DNA Biyosensörleri ile Algılanması:

İncelenen maddenin, DNA ile etkileşmesi sonucu oluşan, DNA’ daki bir bazın veya incelenen maddenin sinyalindeki değişiklikler sayesinde maddenin DNA ile etkileşme türü hakkında bilgi edinilebilmektedir

DNA biyosensörleri kullanılarak DNA – ilaç etkileşimleri başarılı bir şekilde algılanabilmektedir. Bu algılama DNA‟ ya ait elektroaktif bazlar olan guanin/adenin sinyali üzerinden ya da analizi yapılacak ilacın elektrokimyasal sinyali üzerinden sağlanabilir. Bu sinyallerdeki değişimlere göre DNA – ilaç etkileşimleri hakkında yorumlar yapılabilir İlaçların DNA’ya bağlanması ile ilgili çeşitli etkileşim türleri vardır.Bu etkileşim çeşitleri, elektrostatik bağlanma,çapraz bağlanma ve interkalasyonla etkileşmedir.

İlaç-DNA etkileşimini elektrokimyasal biyosensörle tayin ederken izlenen yol

şu şekildedir; Etkileşim öncesi ve sonrası mevcut ilaç sinyalindeki ve/veya DNA’daki elektroaktif bazlar, guanin ve adenin sinyalindeki değişim ölçülür ve bu değişime göre etkileşim hakkında yorum yapılır

A) Çalışma elektrodu yüzeyinde etkileşimin

a) DNA tutturulmuş elektrot, b) ilaç tutturulmuş elektrot kullanılması ile tayin.

B) Çözelti fazında etkileşim. Etkileşim basamağından sonra izlenen basamaklar: elektrodun yıkanması ve voltametrik teknikler kullanılarak

elektrokimyasal ölçümlerin yapılması ve sinyallerin kıyaslanması; etkileşim öncesi ve/veya sonrası ilaç ve/veya DNA’nın voltametrik sinyalindeki artma veya azalmanın bulunması

İlaç-DNA etkileşmesine dayalı elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin (genosensörlerin) tasarımının şematik olarak gösterilmesi

Toksik madde-DNA etkileşmesine dayalı DNA biyosensörleri

DNA biyosensörü kullanımı, son yıllarda toprak, su ve hava gibi çevresel örneklerin analizlerinde kullanılmaya başlanmıştır. Toksik etkisi incelenecek madde, DNA ile sensör yüzeyinde veya çözelti bazında etkileşimi sonrasında, elde edilen sinyal farklanmaları incelenmektedir

Mikroorganizmaların tayinine yönelik DNA biyosensörleri

Toprak, hava, su ve gıdalar içine karışan, hem doğal kaynakları hem de insan sağlığını tehdit ederek çeşitli hastalıklara yol açan mikroorganizmaların tayini için biyosensör tasarımları mevcuttur. Elektrokimyasal DNA hibridizasyon tayini hastalık tayinlerine benzer şekilde gıda maddelerindeki mikroorganizmaların tanısı indikatörlü ve indikatörsüz olarak gerçekleştirilebilmektedir. Bu amaçla tayini yapılacak mikroorganizmanın gen haritasına göre problar seçilir. Çözelti ortamında prob ve hedef birbirini tanıyarak hibritleşir ve bu şekilde tayin yapılır

Bulaşıcı ve kalıtsal hastalıkların tanısına yönelik DNA biyosensörleri

Piezoelektrik Dna Sensörleri

Quartz Crystal Microbalance (QCM)

QCM bir piezoelektrik kütle-algılama cihazıdır.QCM kristalin yüzeyindeki kütle değişimlerinden dolayı kristalin frekansındaki değişimleri ortaya çıkartıyor.

QCM’e dayalı DNA hibridizasyon çalışmalarında bu deney dizaynlarıyla birlikte kullanabileceğimiz 2 farklı yol mevcuttur.Bunlardan biri altın yüzeye doğrudan tiyol grupları içeren probun tutturulmasıdır. Tiyol gruplarının altına olan duyarlılığı bilinmektedir. Bu şeklilde altın yüzeye prob tutturularak biyosensör oluşturabiliriz. Bir sonraki basamakta altın yüzey üzerinde kalan boşluklar tiyol gruplarını engelleyen bir çözelti kullanılarak doldurulur (örneğin 6–merkapto 1–hekzanol). Bu şekilde hem tiyol grubu içeren probun yüzey üzerinde dik kalması sağlanır, hem de eğer altın yüzey probla tam kaplanmamışsa, hedef çözelti ile yüzey arasında oluşabilecek beklenmedik reaksiyonların gerçekleşmesine engel olunulur.Diğer yol ise yüzeyi, bir kaplama ajanıyla kaplayarak DNA tutturulmasının sağlanmasıdır. Bu yöntemin bir diğer adı; kendi kendine toplanan düzenli elektrot yüzeyi tabakaları (self-assemblymultilayers, SAM)’dir

altın yüzey modifikasyonlarında sıkça

kullanılan 3-merkaptopropionik asit (3-MPA).Literatürdeki

çalışmalarda, MPA altına olan ilgisi dolayısıyla, kendiliğinden altına

bağlanma özelliğinden yararlanmak üzere seçilen bir tiyol bileşiğidir. Tiyol ile

kristal yüzey modifikasyonu sağlandıktan sonra diğer bir kovalent bağlama

ajanı olarak kullanılan N-hidroksisakkinimit / 1-etil–3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimide hidroklorür (NHS/EDC) bileşiminin yüzeye tutturulması sağlanır

ve böylelikle yüzey DNA’yı tutturmaya hazır hale getirilmiş olur

KUARTZ KRİSTAL MİKROBALANS İLE DNA HİBRİDİZASYON TAYİNİ VE BAZI MADDELERİN DNA İLE ETKİLEŞİMİNİN BİYOSENSÖRLERLE ALGILANMASI

Tiyol Grupları İçeren Prob ile Yapılan Çalışmaya Ait Bulgular:

Sisteme çözelti gönderilmeye başlandıktan sonra kuartz kristalinin

frekans değişimi gerçek zamanlı olarak izlenmiştir.

1. basamakta sisteme 1μg/mL SH modifiyeli prob

gönderilmiştir. Altın yüzeye SH grupları ile bağlanan probun kütle artışı ile

birlikte kuartz kristal frekansında düşüş görülmektedir. Bu düşüşün değeri 58

hertzdir. 2. basamakta siseme, yüzeye uygun olmayan grupların

110

bağlanmasını önlemek ve probun yüzeyde dik bir şekilde kalması sağlamak

amacıyla 1mM 6–merkapto–1–hekzanol gönderilmiştir. 3. basamakta hedefin

bağlanmasıyla frekans düşüşünü görebilmek için sisteme hedefin

hazırlandığı tampon çözelti gönderildi. (PBS, pH:7,4) Sistem tampon

çözeltiden sonra sabitlenince 4. basamak olarak 5 μg/mL hedef çözeltisi

gönderildi. Kütle artışına bağlı frekans düşüşü 53 Hz olarak saptandı.

QCM ile altın yüzeye SH-lı prob bağlanması ve hibridizasyona

ait frekans değişimleri

KAYNAKLAR

Kazunori Ikebukuro, Yumiko Kohiki, Koji Sode 2002. Amperometric DNA sensor1

using the pyrroquinoline quinone glucose dehydrogenase-avidin conjugate.

Biosens. Bioelectron. 17,1075—1080

Wang, J. 2000. SURVEY AND SUMMARY From DNA biosensors to gene chips.

Nucleic Acids Res. 28(16), 3011-3016

Wang, J., M. Jiang. T. W. Nilsen, R. C. Getts.1998. Dendritic nucleic acid probes

for DNA Biosensors. J. AM. CHEM. SOC. 120, 8281-8282

Zhao, X., R. Tapec-Dytioco, and W. Tan. 2003. Ultrasensitive DNA Detection

Using highly fluorescent bioconjugated nanoparticles. J. AM. CHEM. SOC. 125,

11474-11475

Zhai, J., H. Cui, and R.Yang. 1997. DNA based biosensors. Biotechnol. Adv.

15(1),43-58