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TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
IN SITU
FISH Y CISH
Andrea Martínez
Alicia Tainta
Iñaki Sánchez
TIPOS DE MUESTRAS
In situ
Secuencia diana se va a localizar en un sitio que se encuentra fisiológicamente
Fundamento
Por ello, es necesario colocar estructuras celulares/tisulares en forma de monocapa.
TIPOS
- Preparaciones de cromosomas en metafase
- Extensiones citológicas
- Se obtienen a partir de fluidos biológicos con células en extensión
- Obtención a partir de cultivos de sangre periférica, médula ósea, líquido amniótico...
- Extensión se deja secar y se puede someter a una fijación suave
- Colchicina
- Secciones de tejido
- Preparaciones de núcleos interfásicos desnudos
- Se obtienen a partir de sangre periférica o médula ósea
- El tejido puede estar conservado mediante congelación o fijado en formol e incluído en parafina
- Objetivo: obtener una extensión de núcleos e interfase sobre los que realizar la hibridación
- Pretratamiento:
1. Recubrimiento con adhesivos especiales
2. Portaobjetos cargados positivamente
1. Choque osmótico
2. Fijación
3. Extensión de los núcleos
FISH
(ISH fluorescente)
Se basa en el empleo de sondas marcadas con fluorocromos, que son detectadas visualizando las preparaciones con un microscopio de fluorescencia con los filtros adecuados.
FISH
CISH
(ISH cromogénica)
Se caracteriza porque el híbrido se detecta mediante una reacción inmunohistoquímica que produce un producto coloreado visible con un microscopio óptico convencional de luz transmitida
CISH
Ventajas
Ventajas
- No requiere la extracción y purificación de ác. nucleicos
- Es relativamente rápida y sencilla
- Tiene un coste económico moderado
- Se puede realizar sobre material fresco, congelado e incluso fijado en formo e incluido en parafina.
- Permite obtener información a nivel de célula individual en relación con el resto del tejido.
- Posibilita la realización de estudios retrospectivos.
- Utiliza sondas no radiactivas.
Aplicaciones
Aplicaciones
FISH
FISH
- Se realizan sobre cromosomas en metafases o sobre núcleos interfásicos desnudos e incluso sobre secciones de tejido congelado.
- Su principal aplicación es la detección de alteraciones cromosómicas, en relación con el diagnóstico y pronóstico de patologías oncológicas con base genética.
Detección gen Her2
Cáncer de mama
CISH
- Se realiza principalmente sobre secciones de tejido FFPE.
- Su principal aplicación es la detección de secuencias que permitan precisar el diagnóstico anatomopatológico o aporten información pronóstica:
CISH
1. Detección de secuencias génicas de virus oncológicos
2. Detección de ARNm de las cadenas k y lambda de las inmunoglobulinas
3.Estudios de expresión génica
Detección virus Epstein-Barr
2 TIPOS
Protocolo
FISH
El protocolo es más laborioso porque hay que permeabilizar el tejido con un tratamiento enzimático para que las sondas accedan bien a las secuencias dianas.
FISH
Trata sobre metafases o núcleos desnudos.
HIBRIDACIÓN
Se realiza sobre la preparación
+5ul de la sonda marcada
Cubreobjetos
1º
HIBRIDACIÓN
Portaobjetos
Placa calefactora (72ºC Y 4-5min)
Desnaturalizar el ADN de la muestra y la sonda.
2º
Se incuba en estufa
(37-42ºC y 12-16h)
+
Cámara húmeda
LAVADO DE POSHIBRIDACIÓN
Por inversión de los portaobejetos en
LAVADO DE POSHIBRIDACIÓN
Soluciones de lavado
Cuebetas Copplin
Se fijan condiciones de rigurosidad
CONTRATINCIÓN
1º
Sacar portaobjetos de la cubeta Copplin
Eliminar el exceso de la solución de lavado
Posición vertical sobre papel de filtro
CONTRATINCIÓN
2º
Encima un cubreobjetos
Se dispensan 5-7ul de solución de contratinción
Contiene DAPI
Los núcleos muestran flourescencia azul
Preparación con luz ultravioleta
VISUALIZACIÓN
Verdes y rojos
Filtros adecuados en los fluorocromos en la sonda
Microscópio de fluorescencia
Azul
Cromosomas
Preparaciones metafásicas
Puntos o manchas rojas o verdes
Regiones donde esten las secuencias diana
VISUALIZACIÓN
Preparacion de núcleos desnudos
Color azul con puntos verdes o rojos en su interior
Analizar mínimo 200 núcleos
CISH
Es parecido al FISH.
La diferencia esta en la preparación previa de las secciones de tejido para facilitar la hibridación y en la complejidad de la detención.
DESPARAFINADO Y REHIDRATACIÓN
Eliminar la parafina y rehidratar el tejido
Inversion sucesiva de los portaobjetos
DESPARAFINADO Y REHIDRATACIÓN
+
Las secciones de tejido en cubreobjetos con disolventes orgánicos
Eliminar la parafina y alcoholes de gradación decreciente
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA
Paso clave
Usar formol
Tratamiento enzimático
Permeabiliza el tejido
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA
Libera ácidos nucleicos de su unión a histonas y otras proteínas
Para que las sondas puedan acceder a su secuencia diana
Proteinasa K
2 Enzimas más utilizadas:
Pepsina
PREHIBRIDACIÓN
La finalidad es la misma que el fish pero esta es en tejidos.
PREHIBRIDACIÓN
solución de prehibridación
+
Se realiza inundando el tejido
HIBRIDACIÓN
El mismo que el FISH
HIBRIDACIÓN
LAVADO DE POSHIBRIDACIÓN
Los portaobjetos se lavan por
LAVADO DE POSHIBRIDACIÓN
Inmersión en soluciones de poshibridación
En cubetas Copplin
DETECCIÓN DEL HÍBRIDO
Se marcan con haptenos
Se detectan por métodos inmunohistoquímicos indirectos
Las sondas
DETECCIÓN DEL HÍBRIDO
Se obtiene un producto coloreado
Se deposita en el tejido alrededor del híbrido
Marcador empleado
La elección del método
Tamaño de la sonda
CONTRATINCIÓN
En el tejido aparecen manchas coloreadas
En regiones donde este la secuencia diana
CONTRATINCIÓN
Resto del tejido
La hematoxilina de Mayer
Contrateñir el tejido con tinción suave
VISUALIZACIÓN
Las preparaciones se visualizan con
Microscopio óptico de luz transmitida
VISUALIZACIÓN
La reacción coloreada
Dependiendo de las secuencias detectadas
Núcleo o citoplasma de las células que las contengan
CONTROLES
CONTROLES
- CONTROL POSITIVO DE LA TÉCNICA
- Comprobar que los reactivos funcionan correctamente
- Hibridar muestra
- Comprobar que el tejido ha sido tratado adecuadamente
- Utilizar sondas específicas de secuencias repetidas
- CONTROL POSITIVO DE LA MUESTRA
- CONTROL NEGATIVO DE LA TÉCNICA
- Comprobar que ningún reactivo tiñe de manera inespecífica
- Eliminar sonda
- CONTROL NEGATIVO DE LA MUESTRA
- Comprobar que el resultado es específico
- Sustituir sonda específica por secuencias no complementarias con ác. nucleicos
FISH INTERFÁSICA
- Detección de secuencias de ADN en núcleos en interfase
- Sondas Centroméricas y Sondas específicas de locus.
Variaciones
FISH METAFÁSICA
- Detección de secuencias de ADN directamente en cromosomas en metafase.
- (CGH): Hibridación sobre cromosomas en metafase.
Se emplea para detectar deleción y duplicación.
SONDAS CENTROMÉRICAS
- Hibridan con secuencias localizadas en el centrómero.
- Se emplean para detectar anomalías cromosómicas numéricas.
SONDAS CENTROMÉRICAS
SONDAS ESPECÍFICAS DE LOCUS
- Hibridan en regiones concretas de un cromosoma, implicadas en patologías específicas.
- Se emplean para detectar anomalías cromosómicas estructurales.
SONDAS ESPECÍFICAS DE LOCUS
- Para identificar Traslocaciones se emplean:
- Sondas de separación.
- Sondas de fusión.
- Sondas de separación: La hibridación se realiza con un juego de dos sondas (roja y verde).
- Sondas de fusión: La hibridación se realiza con dos pares de sondas.
SONDAS DE SEPARACIÓN
SONDAS DE SEPARACIÓN Y FUSIÓN
SONDAS DE FUSIÓN
CASO PRÁCTICO
- Identifica la anomalía cromosómica.
- ¿Cómo se llama la sonda empleada en esta técnica de FISH interfásica?