MM - Proteínas

MARCADOR

MOLECULAR

ZIMOGRAMA

- Marcadores Bioquímicos para identificação de genótipos de Feijoeiro -

O feijão de cacho ou guar é uma cultura comercial importante nas regiões de sequeiro, especialmente nas regiões semi-áridas e áridas da Índia.

Somente a Índia contribui com mais de 80% da produção global de guar, seguida de 15% no Paquistão.

ARTIGO: INTRODUÇÃO

O guar é uma fonte natural de nanopartículas de hidrocolóides.

É necessária uma caracterização adequada para facilitar a utilização de genótipos no melhoramento das culturas e distinguir uma variedade de todas as outras variedades.

A cultura pouco conhecida em outras partes do mundo é especialmente importante para a Índia devido ao seu alto valor econômico como mercadoria de exportação. A goma de guar obtida a partir de sementes é amplamente utilizada nas indústrias de papel, mineração, alimentos, cosméticos, têxtil, petróleo e farmacêutica em todo o mundo.

ARTIGO: INTRODUÇÃO

Caracteres descritivos para a avaliação da pureza e identidade varietais são essenciais para o programa de melhoramento, de produção e certificação de sementes de qualidade.

A caracterização do germoplasma utilizando técnicas bioquímicas (proteínas de armazenamento e isozimas) tem recebido grande atenção nas últimas décadas. A eletroforese de proteínas é um método para investigar variações genéticas e classificar variedades de plantas.

ARTIGO: INTRODUÇÃO

ARTIGO: INTRODUÇÃO

As proteínas têm sido utilizadas como marcadores genéticos na identificação de variações entre os taxa de cada espécie; rastrear a pureza do número sempre crescente de cultivares; estabelecimento de relações genômicas; explorar as características importantes de terras e parentes silvestres para proporcionar aumento da produção agrícola e estabilizar a produtividade, e usar informações sobre diversidade genética para tomar decisões sobre a seleção de genótipos superiores para melhorar a produtividade das plantas através do melhoramento.

ARTIGO: INTRODUÇÃO

Foi amplamente sugerido que padrões de bandas poderiam ser um método suplementar importante para a identificação de cultivares, particularmente quando existem disputas legais sobre a identidade de uma cultivar ou quando as cultivares devem ser patenteadas.

Os genótipos de elite de feijão recém-colhidos (Tabela 1) foram obtidos na Universidade Agrícola Sardarkrushinagar Dantiwada, Sardarkrushinagar, Gujarat. As sementes foram limpas e secas para um nível seguro de umidade (<9%) e classificadas em tamanho uniforme e usadas para estudos.

MATERIAL E

MÉTODOS

PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

As plântulas com dez dias de idade de cada genótipo foram esmagadas por pistilo e almofariz usando 200 µl de tampão de extração Tris 0,1 M. A amostra do solo foi mantida a 4 ° C durante a noite para extração de proteínas. Em seguida, a suspensão foi centrifugada sob refrigeração a 10.000 rpm por 10 min e o sobrenadante transparente foi coletado. A este sobrenadante, foi adicionado um volume duplo de acetona gelada e centrifugado. O sedimento foi formado e dissolvido em 30 µl de tampão Tris 0,1 M. Este extrato de proteína foi dissolvido em igual quantidade de tampão de trabalho e mantido em água fervente a 90 ° C por 10 minutos e mantido a 4 ° C para resfriamento e carregado no gel.

O gel de empilhamento (5%) foi preparado misturando 1,0 ml de acrilamida a 30%, 1,5 ml de tampão de gel de empilhamento, 3,4 ml de água destilada, 0,07 ml de APS a 10% e 0,02 ml de TEMED.

PREPARAÇÃO DO GEL

O gel de resolução (15%) foi preparado misturando 12,5 ml de solução de acrilamida a 30%, 6,3 ml de tampão de gel de resolução, 5,7 ml de água destilada dupla, 0,25 ml de SDS a 10%, 0,25 ml de SDS a 10%, 0,25 ml de APS a 10% e 0,06 ml de TEMED.

Os reservatórios superior e inferior da unidade eletroforética foram preenchidos com tampão de eletrodo. Em seguida, 50 a 60 µl de extrato de proteína foram carregados nas cavidades do gel de empilhamento por camadas de bainha sob tampão de eletrodo usando micropipeta. Uma corrente de 1,5 mA por poço com uma voltagem de 80V foi aplicada até o corante de rastreamento cruzar o gel de empilhamento. Posteriormente, a corrente foi aumentada para 2 Ma por poço e a voltagem para 120V. A eletroforese foi interrompida quando o corante de rastreamento chegou ao fundo do gel de resolução, que levou de seis a oito horas.

A eletroforese foi realizada em gel de placa vertical de 16 cm x 14 cm x 1 mm de dimensão.

ELETROFORESE

A coloração com prata foi feita para o gel obter perfis de proteínas.

Uma vez desenvolvidas as bandas, o gel é lavado com água destilada dobrada por 20 segundos e o gel é fixado com ácido acético.

COLORAÇÃO

DO GEL

Análise eletroforética de esterase

A esterase (EST) foi analisada quanto ao padrão isozimático, conforme descrito por Glaszman et al (1988) com ligeira modificação. As mudas foram criadas a 25° C e foram usadas mudas de cinco dias para esse fim.

ESTERASE

Preparação da amostra

As plântulas com cinco dias de idade foram moídas em um pilão e mortor com 50 µl de tampão de extração sob condição de gelo. O sobrenadante foi coletado e 10 µl de corante de rastreamento (1% de azul de bromofenol contendo 0,05% de glicerol) foram adicionados a cada tubo. Foram utilizados 50 µL de extrato da amostra para carregamento.

Coloração do gel

A solução de coloração foi preparada dissolvendo 200 mg de sal RR azul rápido por 250 ml de tampão fosfato 0,5 M.

Todo o perfil de bandas de proteínas foi dividido em sete regiões (A a G), com base na ordem decrescente de peso molecular.

A presença ou ausência de banda ou grupo específico de bandas e suas intensidades relativas foram tomadas como critério para caracterização dos genótipos.

Os genótipos diferiram quanto ao número de bandas, mobilidade relativa (Rm) e intensidade.

A diferença consistente no perfil protéico sugere que cada genótipo tem um perfil reprodutivelmente estável como conseqüência de seu arranjo genético específico.

A expressão desses caracteres morfológicos não é estável ao longo da estação, ano ou local, devido à alta interação com o ambiente. Os caracteres fenotípicos são influenciados significativamente por flutuações ambientais.

Além disso, torna-se difícil distinguir variedades intimamente relacionadas apenas por caracteres morfológicos, pois as diferenças fenotípicas dentro da espécie são muito pequenas para serem discriminadas.

As proteínas de semente são o produto de genes estruturais e apresentam-se comparativamente em grande quantidade e podem ser fácil e rapidamente extraídas.

RESULTADOS E

DISCUSSÃO

RESULTADOS E

DISCUSSÃO

RESULTADOS E

DISCUSSÃO

RESULTADOS E

DISCUSSÃO

As isoenzimas das esterases (EST) têm sido consideradas como uma ferramenta eficaz para a caracterização, pois essa isozima é conhecida por exibir alto polimorfismo (Varier et al., 1999). No presente estudo também se observou polimorfismo nos perfis de isoenzimas da esterase em relação ao número, posição e intensidade das bandas entre os genótipos.

A separação eletroforética e a visualização do polimorfismo de isozimas também têm sido os procedimentos mais usados para estimar a diversidade genética de plantas em vários gêneros de plantas.

O número de locos polimórficos (% de locos polimórficos) e o número médio de alelos por locos polimórficos são dois dos parâmetros de diversidade genética que fornecem uma estimativa da extensão da diversidade mantida pelas espécies vegetais

RESULTADOS E

DISCUSSÃO

RESULTADOS E

DISCUSSÃO

RESULTADOS E

DISCUSSÃO

ARTIGO: INTRODUÇÃO

A partir desses resultados, fica claro que existe variação suficiente no perfil de isoenzima da proteína e esterase entre os genótipos e pode ser considerado como uma ferramenta para identificação e rastreamento de genótipos de várias características.