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Sonda de DNA
Universidade Federal de Uberlândia - UFU
A. M. Biomolecular
Drª Luana Pereira dos Santos Lopes
Junh 2018
O que são?
Sondas de DNA
A principal função das sondas é identificar, entre um conjunto de moléculas de ácidos nucleicos, a chamada sequência-alvo.
As sondas são sequências de nucleotídeos complementares desenvolvidas a partir de segmentos conhecidos do DNA ou RNA que se deseja identifica.
Função
Principal função à identificar, entre um conjunto de moléculas de ácidos nucleicos, determinada sequência-alvo.
A hibridação de DNA-DNA geralmente refere-se a uma técnica biológica molecular que determina o grau de semelhança genética entre combinações de sequências de DNA.
Hibridização
de DNA-DNA
Esta técnica geralmente é usada para determinar a distância genética entre duas espécies. Quando várias espécies são comparadas dessa forma os valores semelhantes permitem que as espécies sejam dispostas em uma árvore filogenética; isto é o que torna possível a realização do sistema molecular.
Quais os Tipos?
É eleita como sonda uma molécula que possua sequência o mais complementar possível em relação à sequência-alvo.
São várias as técnicas de biotecnologia que utilizam a hibridação como princípio do método.
Northern – Blot
O Southern-blot é uma técnica desenvolvida por E. M. Southern na década de 70 que permite a detecção de fragmentos de DNA. Nesta técnica o DNA é digerido com enzimas de restrição e os fragmentos resultantes são separados por electroforese em gel de agarose. Após a desnaturação e transferência do DNA para uma membrana, híbrida-se com uma sonda apropriada e visualiza-se os resultados. O Southern-blot permite detectar RFLPs, VNTRs e modificações do DNA genómico, sendo utilizado para diagnósticos moleculares.
Southern – Blot
O Northern-blot é uma técnica análoga ao Southern-blot, diferindo apenas no ácido nucleico em estudo, neste caso é o RNA. Este tipo de análise é importante para verificar a expressão de um certo gene, o tecido ou tipo celular onde ocorre e os factores que a regulam.
Colony – Blot.
Na técnica de colony-blot faz-se o rastreio de uma série de colónias transformadas com bibliotecas de cDNA ou de DNA genómico de um certo organismo. Estas colónias depois de crescerem são transferidas para uma membrana de nylon e após lise celular e fixação do DNA na membrana, esta é hibridada com uma sonda (cDNA ou DNA genómico) para o gene que se pretende estudar. Por autorradiografia visualiza-se qual a colónia que continha o DNA que hibridou com a sonda e isola-se o plasmídeo correspondente.
Funcionamento
O termo sonda (também sonda de hibridização) refere-se ao DNA de cadeia simples, marcado com um radioisótopo (por exemplo o, 32P) ou biotina..
1 - Eletroforese
2 e 3 - Transferencia para membrana de nitrocelulose ou de nylon.
4 - Hibridação com sonda marcada.
. Lavagem
5 - Membrana com a sonda
6 - Visualização da marcação da sonda atraves de raio X.
Southern-blot
Colony-blot
Artigo
A técnica de hibridização in situ (ISH) tem sido usada para identificar mRNA (ou DNA) em amostras de tecido de material humano e animal.