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SONDAS DE ADN

MERCEDES BABIANO MARTÍNEZ

SONDA DE ADN RECOMBINANTE

SONDA

Se obtienen por un proceso de clonación y amplificación por cultivo

La sonda se obtiene de la siguiente manera

  • El fragmento de ADN que queremos emplear se inserta en un vector (PLÁSMIDO)
  • El plásmido se inserta en una bacteria y se cultiva
  • Se extrae el plásmido amplificado y se emplea como sonda completa o se fragmenta

Proceso

Caracterizadas por:

Mayor especificidad

Bicatenarias

Características

Mayor tamaño y sensibilidad

TIPOS DE MARCADORES

Marcadores

MÉTODOS DIRECTOS

MÉTODOS INDIRECTOS

DIRECTO

ISÓTOPOS RADIACTIVOS

Más utilizados

Fósforo-32

Se utilizan en técnicas como Nothern blot

Tiritio

La detección del hírido se realiza mediante autorradiografía

El marcaje de la sonda se produce introduciendo nucleótidos radiactivos que contienen alguno de estos isótopos

Se consigue una gran sensibilidad

INDIRECTO

HAPTENOS

Más utilizados

Biotina

La detección del híbrido requiere métodos indirectos de revelado basados en:

Digoxigenina

Moléculas de gran tamaño que se acoplan a los nucleótidos

- La afinidad química de moléculas

- En métodos inmunológicos

Su sensibilidad es menor

DESPLAZAMIENTO DE MELLA

MARCAJE

ESQUEMA

proceso

PROCESO

Necesitaremos:

Se utiliza para:

- Marcar sondas de ADN bicatenario obtenidas normalmente por tecnología de ADN recombinante

- ADNasa I

- ADN polimerasa I bacteriana

- Mezcla de desoxirribonucleótidos trifosfato, uno de ellos está marcado con un isótopo radiactivo o hapteno

PROCESO

La ADNasa I a bajas concentraciones y en presencia de cationes de magnesio rompe enlaces fosfodiéster entre dos nucleótidos consecutivos de la cadena al azar, produce mellas.

La ADN polimerasa I intenta reparar las mellas. Para ello gracias a su actividad exonucleasa 5'->3', va eliminando nucelótidos uno a uno desde la mella hacia el extremo 3'.

A la vez, gracias a su actividad polimerasa 5'->3', incorpora desoxirribonucleótidos en el extremo 3'-OH libre de la mella sintetizando ADN complementario a la hebra intacta

Los nuevos nucleótidos que incorpora se toman del medio de reacción y uno de ellos está marcado. Así, la ADN polimerasa desplaza la mella a lo largo de la cadena de ADN sustituyendo nucleótidos sin marcar por nucleótidos marcados

ATENCIÓN

VíDEO

En este vídeo se ve de una forma muy simple y sencilla lo que ocurre en esta técnica.

VíDEO

Purificación de la sonda marcada

Métodos más utilizados:

PURIFICACIÓN

Eliminación de los nucleótidos libres marcados para evitar el ruido de fondo o interferencias en los resultados de las técnicas de hibridación

- Cromatografía por exclusión de tamaño

- Cromatografía de adsorción

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