Klinikte Sitogenetik

Klinikte Sitogenetik

Sitogenetik ve Moleküler Sitogenetik Tanı Yöntemleri

Bölünme halindeki her kromozomda 2‟şer çift kromatid bulunur. Bu kromatid çiftleri sentromerde birbirleri ile birleşirler.

I.Sitogenetik Tanı Yöntemleri (Konvansiyonel)

Kromozomlar ışık mikroskobu kullanılarak hücre bölünmesinin metafaz evresinde çok rahat incelenebilirler.

Kromozomlar bölünme halindeki bir hücreye ait olan kromonema ipliklerinin kısalıp kalınlaşması ve spiralleşerek etraflarında bir matrix oluşturmasıyla meydana gelen genetik materyali taşıyan yapılardır.

1.Klasik Sitogenetik Tanı Yöntemleri

2.Özelleşmiş Sitogenetik Tanı Yöntemleri

a.Özelleşmiş Sitogenetik

b.Mikronükleus (MN)

c.Frajil Bölge Tayini

II.Moleküler Sitogenetik

İnsanda 2n=46 (1956, Tijo ve Levan) “Modern sitogenetiğin başlaması”

1.Akış Karyotiplemesi (Flow Karyotyping)

2.Floresans in Situ Hibridizasyon(FISH)

3.Fiber FISH

4.Multicolor FISH

a.Spectral Karyotyping(SKY)

b.Multiplex-FISH (M-FISH)

c.R-FISH

d.Cobra- FISH

e.Komparatif Genomic Hibridizasyon (CGH)

İnsan genom projesinin tamamlanması ile genomun yapısı hakkındaki bilgilerimiz, genomu analiz etme ve bu bilgileri kullanma kapasitemiz giderek artmaktadır. Genomda mutasyonların görülme aralığı tek nükleotid değişikliklerinden, tüm kromozom değişikliklerine uzanır. Mikroskopik ve submikroskopik olarak ortaya çıkan genomik dengesizliği farklı duyarlılığı olan çeşitli metodlarla göstermek mümkündür.

Sitogenetik, genetik materyali hücresel düzeyde inceleyen bilim dalıdır. Kromozomların işlev ve morfolojileri mitotik/ mayotik metafaz sürecinde değerlendirilir.

Amaç, kromozomlar halinde paketlenmiş DNA’da meydana gelen yapısal (translokasyon, delesyon, insersiyon, inversiyon, duplikasyon vb.), sayısal (anöploidi, poliploidi vb.) değişiklikleri ve köken farklılıklarını (kimerizm, mozaisizm, vb.) saptamak, elde edilen sonuçla fenotip ile genotip arasındaki ilişkiyi değerlendirmektir.

Kromozoma Genel Hatları ile Bakış

Sekonder Darlık: Sentromerden farklı olarak oluşan küçük bir darlıktır. Özellikle 1, 3, 6, 9, 11 ve 16. kromozomlarda görülürler

Satellit: Belirli bazı kromozomların kısa kollarına ince bir sapla bağlanan kromatin materyalidir.

Sentromer (Primer boğum): Heterokromatin yapıda özel DNA dizisi içeren kısımdır. Kromozomlar sentromer bölgesinde boyuna bölünüp ayrılırlar. Sentromerlerin üzerinde uçları kutuplara dönük olan özelleşmiş protein komplexlerine kinetokor denir. Bölünme esnasında kromatitler bu noktalardan kutuplara çekilirler.

Kromozomlar sentromerlerinin lokalizasyonu dikkate alınarak sınıflandırılır. Buna göre tüm kromozomlar kendi içlerinde morfolojik olarak 3 gruba ayrılır:

Metasentrik: Sentromeri ortada olan ve iki kolu birbirine eşit olan kromozomlardır.

Submetasentrik: Sentromeri merkezden uzak ve iki kolunun uzunluğu da birbirine eşit olmayan kromozomlardır. Akrosentrik: Sentromer bölgesi kromozomun bir ucuna daha yakın olan kromozomlardır.

Moleküler Sitogenetik Tanı Yöntemleri

Telosentrik: Sentromer kromozomun bir ucuna çok daha fazla yakın ve ikinci kolun görünmediği kromozomlardır

2) Fiber FISH

1) Floresans In Situ Hibridizasyon (FISH)

FISH, sentetik nükleik asit dizileri (Prob) hücre içinde genomik DNA‟ya hibridizasyonu aracılığı ile genomik DNA‟daki yapısal ya da sayısal değişmeleri tespit etmeyi sağlayan bir tekniktir.

İnterfaz kromatin lifleri kullanılarak DNA fragmentlerinin floresan boyalarla işaretlenerek daha yüksek rezolüsyonlu haritalama gerçekleştirilir. İnterfaz evresinde kromozomlar daha az kondanse oldukları için yoğunlukları metafaz evresinden daha düşüktür. İnterfaz durumunda birkaç yüz kb uzaklıkta olan belirleyiciler farklı renkteki boyalarla işaretlendiklerinde birbirlerine göre sıralarını belirlemek mümkün olmaktadır.

I.Sitogenetik Tanı Yöntemleri (Konvansiyonel)

FISH tekniğinin kullanım alanlarına örnek olarak;

1. Prenatal sendromik tanımlamalarda,

2. Postnatal sendromik tanımlamalarda,

3. İnterfaz ve metafaz hücrelerinde aberasyon tanımlamalarında,

4. Dokuda enfeksiyon ajanlarının tanısında,

5. Gen haritalamasında,

6. Somatik hücre hibrit analizlerinde,

Hibridizasyonda üç temel aşama önemlidir;

1. Hedef dizilerin hibridizasyon sırasında yeterince açık olması ve bu açıklığın yeterli süre korunması,

2. Probla hedefin yüksek affiniteyle birbirlerine bağlanması,

3. Hibridizasyonun spesifik aktivitesi yüksek bir işaretleyici ile görüntülenmesidir.

Fiber FISH’in Metafaz FISH ve İnterfaz FISH’ten farklı gösterimi

Klinikte kullanımı: Fiber FISH tekniği genetik hastalıkların tanımlanmasında son derece yararlı olmuştur. Çünkü bu teknik bir hastalıkla ilgili genin çevresindeki farklı genlerin sırası ve aralarındaki uzaklıklar hakkında detaylı bilgi verebilmektedir.

5) Gümüş-NOR bantlama yöntemi

FISH tekniğinde kullanılan problar

1. Lokusa spesifik problar

rRNA‟ları kodlayan gen bölgeleri özellikle akrosentrik kromozomların kısa kollarında lokalize olmuştur. rRNA‟ların yoğunlukta olduğu bu bölgelere nükleer organizer bölgeler (NOR) denilmektedir ve bu bölgeler gümüş boyalarına karşı yüksek afinite gösteren bölgelerdir. Gümüş nitrat ile NOR siyah noktalar şeklinde boyanır. Bu afinite nonhiston proteinler olan Ag-NOR proteinlerin varlığına bağlıdır. Metafaz safhasındaki hücrelerde bulunan iki önemli Ag-NOR proteini transkripsiyonda görevli UBF (upstream binding factor) ve RPI (RNA polymerase I) proteinleridir.

3. Kırık noktası yeniden düzenlenme (break apart reaarangement) probları

1) Giemsa bantlama yöntemi (G bantlama)

NOR: 18S ve 28S rRNA genlerini içeren bölgedir.

p 53 mutasyonu (spektrum orange)

Kırık noktası yeniden düzenlenme

Giemsa kullanılarak yapılan boyama yöntemidir. Bu boyama yönteminin temelinde kromozomların yapısında yer alan proteinlerin tripsinizasyon yöntemi ile uzaklaştırılması yatar. Proteinleri uzaklaştırılmış kromozomlar giemsa ile boyandıkları zaman enine açık ve koyu renkte bantlar elde edilir. AT‟ce zengin ve bölgeler koyu boyanırken GC‟ce zengin boyalar açık renk bantları meydan getirir. AT‟ce zengin bölgelerde transkripsiyon düşük düzeydedir. GC‟ce zengin bölgeler ise korunmuş genleri içerir. Koyu renk bölgelerde paketlemenin daha sıkı olması nedeniyle, bu bölgede yer alan DNA‟ya bağlı proteinlerin tripsinizasyonla kaybolmadığı düşünülmektedir.

Klinikte kullanımı: Bu sitogenetik çalışma ribozomal gen aktivitesinin tanımlanması hakkında fikir vericidir.

3) Reverse bantlama yöntemi (R bantlama)

Klinikte kullanımı: Bu teknikten faydalanarak kromozomlarda meydana gelen sayısal ve yapısal aberasyonlar tespit edilebilir. Öploidi, anöploidi, delesyon, duplikasyon, translakosyonlar idiogram grafikleri ile karşılaştırılarak anomaliler saptanabilir.

4. α-satellit probları

G banlamanın tersi anlamına gelen “reverse” R bantlama denilmiştir. Yüksek ısı ve kontrollü pH ile muamele edilen preparatlar giemsa ile boyanır. G ve Q bantlama da soluk olarak boyanan telomerik bölgelerin daha koyu boyanmalarına imkan vermektedir. Kromozomların uç kısımların bulunan anomalilerin tespitinde sıklıkla tercih edilir.

t(9:22) tek füzyon translokasyonu

α satellit bölge

3) Multicolor-FISH

2. Translokasyon probları

• Tek füzyon (single fusion)
• Çift füzyon (dual fusion)
• Tek füzyon ekstra sinyal (extra signal)

a) Spektral karyotipleme (SKY): Tekniğin esası beş farklı renkte florokrom boya kullanılarak 24 kromozomun eş zamanlı olarak farklı renklerde boyanması ve tek tip bir floresans mikroskoptan analizine dayanmaktadır. Aynı anda bir metafaz plağı üzerinde yer alan tüm kromozomların farklı renkte görüntülenmesine ve birbirinden ayrılmasına imkan verir. Her bir kromozom kendine ait farklı bir floresansta izlenir.

5. Tüm kromozom probları

t(8:21) Çift füzyon translokasyon

Klinikte kullanımı: Sayısal ve yapısal anomalilerin tespiti için alternatif bir tekniktir.

Tüm kromozom boyama

Klinikte kullanımı: Bu teknik ile 1.5 Mb‟nın (1 Mb: 10000 bp) altındaki parça değişimleri saptanabilir. Klasik bantlama tekniklerinden üstünlüğü çok küçük boyutlardaki anomalilerin daha kolay tanımlanabilmesine olanak vermesidir.

6. Telomer probları

t(9:22) Tek füzyon ekstra sinyal translokasyon

b) Multiplex FISH (M-FISH): SKY FISH‟te olduğu gibi 5 farklı florokromun çeşitli kombinasyonları ile hazırlanmış probların hibridizasyonuna ve farklı floresan sinyallerin analizine dayanan bir tekniktir. Beş farklı florokromdan yansıyan floresan ışığın bilgisayarda üst üste çakıştırılarak değerlendirilmesi esasına dayanır.

Klinikte kullanımı: Kromozomlarda meydana gelen yapısal ve sayısal anomalilerin belirlenmesinde kullanılır. Sayısal anomaliler bazı sendromlara sebep olmaktadır. Yapısal kromozomal anomaliler ise pek çok kanser türünün etyolojisinde önemli rol oynamaktadır.

Telomer bölge işaretleme

Klinikte kullanımı: Bu tekniğin sadece sentromer bölgesine özgü veya sadece telomer bölgesine özgü uygulanan tetkikleri de mevcuttur (speicher karyotipleme). Tüm kromozom kayıplarının belirlenmesinde tercih edilebilir.

4) Sentromer bantlama yöntemi (C bantlama)

c) Cobra-FISH (Combined binary ratio FISH): Bu teknikte diğer FISH yöntemlerinde farklı olarak 4 florokrom kullanılmaktadır. 24 kromozom iki ayrı grupta 12‟şerli olarak incelenir. Birinci grup 3 farklı florokromla incelenirken diğer gruba 4. bir florokrom ilave edilir. Florokrom sayısının çok fazla önemi yoktur 5 tane de kullanılabilir.

2) Floresans bantlama (Kinakrin bantlama) yöntemi (Q bantlama)

“Yapısal heterokromatin bantlama” olarak da adlandırılır. C bant bölgelerinde bulunan histon olmayan proteinler bölge DNA‟sına çok sıkı bir şekilde bağlanmışlardır. Ayrıca tekrarlayan satellit DNA‟da histon proteinlerce sıkı bağlanmıştır. Bu DNA bölgeleri asit ve alkol ile muamele edildiğinde C bant içeren bölgelerin dışında kalan DNA bölgeleri kaybolurken, C bant bölgesindeki DNA korunarak saklı kalır. İnsan kromozomlarında koyu boyanan C bant bölgeleri sentromere lokalizedir. Bu durumun tek istisna olduğu bölge Y kromozomudur. Burada C bant bölgesi Y kromozomunun uzun koluna lokalizedir. Kromozom kayıpları bu yöntemle değerlendirilebilir.

Sitolojide kullanılan bazı boyalar floresans ışıma yapar bunlara “fluorochrome” denir.

Klinikte kullanımı: Bu teknik genellikle kromozom kollarına özgü boyama sağladığı

için tercih edilir (165,166).

Klinikte kullanımı: Tüm kromozom kayıplarında ya da trizomi şüphelerinde sıklıkla başvurulan bir tekniktir.

6) Kardeş kromatid değişimi (SCE)

Quinacrine mustard ve Quinacrine dihyrocloride gibi floresan boyalar kullanılarak yapılan bantlama şeklidir. Bunun dışında sıklıkla kullanılan floresan boyalar Floresan isothiocyanat (FITC), Tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC) ve 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)‟dir. Parlak ve soluk renkli bantlar elde edilir. Parlak renkler AT‟ce zengin bölgeleri işaret ederken soluk renkler GC‟ce zengin bölgelere karşılık gelir. 1., 9., ve 16. kromozomların sentromer bölgelerinde, akrosentrik kromozomların satellit bölgelerinde ve Y kromozomunda farklılıklar göstermektedir

d)CGH(Comparative Genomic Hybridization): temeli FISH’e dayanan, farklı floresan boya ile boyanmış test (hasta) ve referans DNA örneklerinin normal kromozomlara bağlanması ile elde edilen floresan renk farklılıklarını gösteren bir sitogenetik yöntemdir.

Yöntem ile hasta DNA’ sında kromozomal kayıp (loss) veya belli bir bölgenin amplifikasyonu (gain) gösterilir.

4) Akım karyotipleme (Flow karyotipleme)

Kardeş kromatidler arasında birbirine eş

segmentlerin karşılıklı olarak yer değiştirmesidir.

7) Mikronükleus tekniği

SCE analizi DNA hasarını kromozomal düzeyde gösterebilen bir yöntemdir. Vücudumuzdaki toplam DNA‟nın %1‟inden daha azında bile meydana gelebilecek değişimler bu teknik ile ortaya konabilir.

Tekniğin temeli hücrelerin bir sıvını içinden teker teker geçmesine ve hücreler hakkındaki verilerin istatistiksel olarak bilgisayar ekranına

yansımasına dayanır.

Mikronükleuslar hücre bölünmesi esnasında ortaya çıkan esas çekirdek dışındaki kromozomlar veya asentrik kromozom parçalarıdır. Mitotik iğdeki hatalar nedeniyle kutuplara çekilemeyen kromozomların sitoplazmada yoğunlaşması sonucu oluşurlar. Bu nedenle MN kromozomal fragment veya tüm bir kromozom içerebilir.

Klinikte kullanımı: İncelemeler floresan mikroskop altında yapılmak zorunda olduğundan tespit edilen veriler fotoğraflanarak bilgisayar ortamına aktarılarak saklanmalıdır. G bantlamada olduğu gibi sayısal ve yapısal anomalilerin tespitinde yardımcı olabilen alternatif bir tekniktir.

a)FISH için hazırlanan DNA problarının farklı amaçları vardır. Hazırlanan problar hibridizasyonda iki farklı şekilde bağlanırlar. Bunlar direkt işaretleme ve indirekt işaretleme şeklinde ayrılırlar.

b)İndirekt işaretleme için, prob hapten içeren modifiye nükleotidlerle oluşturulurken direk işaratlemede ise hazırlanan prob florokromun direk bağlandığı nükleotidlerle oluşturulur. Direk işaretleme yöntemi daha kısa sürede tamamlanmasına karşın floresan sinyalin kalıcılığı indirek işaretlemeye nazaran çok daha kısa sürelidir.

c)İşaretli prob ve hedef DNA denatüre edilerek tek zincirli hale getirilir. d)Komplementer dizileri ile hibridize olmak üzere probun lam üzerindeki hücresel DNA ile birleşir.

e)Eğer prob indirekt işaretli ise görüntüleme için fazladan bir uygulama daha yapılmalıdır. Floresan işaretleyicileri taşıyan ve haptenler tarafından yakalanacak olan antikorların ortama konulması gerekir.

Klinikte kullanımı: Mikronükleus sayısındaki artış anöploidiyi uyaran çeşitli mutajen veya karsinojenlerin hücrede yol açtıkları sayısal ve yapısal kromozom anomalilerinin dolaylı olarak değerlendirilmesini sağlar. Genellikle genotoksisite değerlendirme testi olarak da isimlendirilir. Karsinojenlerin ve farmasötik ajanların yaptıkları sitogenetik harabiyetin tespitinde sıklıkla tercih edilir Fiziksel ve kimyasal ajanların sebep olduğu sitogenetik hasarın tespitinde, radyolojik kazaların genetik materyal üzerine oluşturduğu hasarı belirlemek için, iyonizan radyasyon gibi dış etkenlerin mikronükleus oluşumuna etkisi ve mikronükleus oluşumunun sayısal ve yapısal kromozom anomalileri üzerine indirek etkisinin araştırılmasında kullanılabilir.

Klinikte kullanımı: Bu teknik Bloom Sendromu ve çeşitli genotoksiklerin etkilerinin araştırılması için kullanılmaktadır.

Klinikte kullanımı: Hücre tiplendirme, apoptoz gibi çalışmalarda tercih edilmektedir.

Örneğin; AIDS hastalarının kanında CD4 lenfosit seviyesinin izlenmesinde kullanılmaktadır.

8) Frajil bölge tespiti

Frajil bölgeler kromozomlar üzerinde yer alan, özel kültür koşulları altında bazı faktörler tarafından baskılanınca boyanmadığı gözlenen kırıklar, aralıklar ve triradiyal bölgelerdir.

Frajil bölgeler kalıtsal geçiş gösterebilirler. Örneğin klinik olarak anlamlı olduğu tespit edilmiş olan Frajil X sendromunun sorumlusu fra Xq27.1 bölgesidir

Klinikte kullanımı: Frajil bölgelere bağlı klink durumların tespiti için kullanılır Örneğin frajil x sendromu

Prob; örneklerde aranan genetik materyale (DNA veya RNA) komplementer, radyoaktif veya nonradyoaktif (günümüzde floresan) madde ile işaretli DNA veya RNA segmentidir.