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punto de vista metodológico, las técnicas moleculares para genotipificación pueden clasificarse en cuatro grandes grupos:
a) aquellas basadas en el estudio del electrocarioti-po (de un segmento del genoma o del genoma completo) mediante electroforesis de campo pulsado (PFGE)
b) las relacionadas con la amplificación de fragmentos de DNA por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
c) las que involucran la secuenciación parcial o total del genoma de los microorganismos
d) aquellas en las cuales se obtienen perfiles mediante la hibridación de ácidos nucleicos. Cada una de estas herramientas ha ofre-cido una alternativa de gran utilidad para la investigación epidemiológica, sin embargo, su aplicación se encuentra limitada al caso particular en estudio.
. Muchas de la especies causantes de infec-ciones son también organismos comensales de humanos, por lo cual es importante determinar si la cepa analizada es la causante de la infección o si simplemente, es un comen-sal que fue aislado como contaminación, durante el proce-so de toma de muestra
Por ejemplo, para establecer la relación genética entre aislados de una misma fuente, pero que manifiestan dife-rencias a nivel fenotípico o, por el contrario, aislados pro-venientes de distintos pacientes pero que muestran caracte-rísticas fenotípicas similares. La confirmación de la rela-ción genética entre estos microorganismos permitiría de-terminar la fuente de la infección, el número de clones circulantes, el vehículo, la ruta y el patrón de distribución. El conocimiento que brindan las técnicas de genotipifica-ción permite la implementación de nuevos programas que contribuyan al control y prevención de los brotes infeccio-sos.
así discriminar entre re-infección por el mismo clon o infección por un clon distinto. Si el microorganismo cau-sante del segundo cuadro infeccioso es el mismo que causó la infección original, se puede considerar la posibilidad que se esté aplicando un tratamiento antimicrobiano inade-cuado o poco efectivo, siendo necesario entonces la im-plementación de una terapia alternativa.
técnica en la cual, el ADN genómico de los aislados en estudio es digerido con endonucleasas. Los segmentos generados, de peso molecular elevado, son separados en un gel de agarosa, gracias a la aplicación de campos eléctricos cuya direccionalidad cambia a intervalos predeterminados . Como resultado se obtiene un patrón de bandas ca-racterístico para cada aislado. Tenover y colaboradores, propusieron un criterio que permite interpretar el electro-cariotipo de diversas cepas de manera tal que, se puedan establecer las relaciones genéticas y epidemiológicas entre dichos microorganismos. Según este sistema se puede clasificar a los aislados bacterianos en cuatro categorías:cepas indistinguibles, cepas estrechamente relacionadas, cepas posiblemente relacionadas y cepas no relacionadas
PFGE es la técnica que tiene el más alto poder discrimina-torio, la mejor reproducibilidad y la de mayor versatilidad,sirva como fuente de comparación [15]. Las ventajas enu-meradas han convertido al PFGE en la técnica estándar de referencia para la tipificación de bacterias, hongos y pará-sitos de importancia clínica.
A pesar de sus múltiples ventajas, el uso del PFGE se encuentra limitado en ciertas situaciones debido a su labo-riosidad así como por el tiempo requerido para obtener los resultados (2-3 días). Por esta misma razón, resulta inadecuado para el análisis de poblaciones numerosas o colectadas por períodos superiores a un año
Para la determinación de la clonalidad entre microorga-nismos se debe definir el nivel de relación genética necesa-rio para diferenciar los clones y, el o los marcadores que permitan establecer dicha diferencia. El punto de corte a partir del cual se considera que dos microorganismos no se encuentran clonalmente relacionados es arbitrario y de-penderá del problema concreto y de la herramienta utiliza-da para resolverlo. En este sentido, se debe tener especial
La aparición de un cuadro infeccioso en un paciente o de un brote en una comunidad u hospital pone en marcha una serie de medidas destinadas a su control. En primera instancia, se realiza el aislamiento del patógeno y su clasi-ficación. Conocido el microorganismo responsable de la infección deben definirse con precisión su origen, la cadena epidemiológica que ha conducido a la infección y las medidas de control adecuadas.
Los rasgos fenotípicos son susceptibles a la influencia del ambiente, que pueden pro-vocar variaciones en la expresión genética, por lo cual, el resultado obtenido a través de la detección de este tipo de caracteres puede presentar poca estabilidad, reproducibili-dad o poder discriminatorio. Adicionalmente, presentan la desventaja de encontrarse, en algunos casos, limitados a unas pocas especies. Resultan además, poco prácticos para el análisis de microorganismos de crecimiento lento, difi-cultoso o no cultivables ya que, generalmente, requieren la multiplicación de los mismos, y resultan poco apropiados para determinar las relaciones de clonalidad entre mi-croorganismos, presentando una limitada capacidad de identificación a nivel de subespecie, subtipo o cepa.
Los métodos genotípicos están basados en la detección del material genético del organismo, por lo tanto son inde-pendientes de los cambios en el patrón de expresión gené-tica y de las influencias ambientales, ofreciendo una alter-nativa con mayor estabilidad y reproducibilidad. No re-quieren necesariamente el aislamiento y cultivo de los microorganismos, siendo posible obtener los resultados en tiempos más cortos y, usualmente con mayor poder de resolución, sensibilidad y especificidad que los métodos fenotípicos.
3) Estabilidad: el marcador biológico detectado por el método deberá poder ser determinado a lo largo del tiempo y no depender, de forma importante, de las variaciones en el genoma del microorganismo o de su patrón de expresión genética. 4) Poder discriminatorio: permite ubicar, con una probabilidad elevada, a individuos distintos en grupos diferentes. 5) Concordancia epidemio-lógica: capacidad del método para arrojar resultados simi-lares a los obtenidos a través de otras técnicas. 6) Eficacia:estudia el balance entre los costos económicos generados por la aplicación del método y las ganancias obtenidas por la población al lograr la prevención y control de la enfer-medad. Es de esperar que un método epidemiológico per-mita establecer una buena relación entre los logros obteni-dos y el esfuerzo realizado, tanto a nivel económico como en recursos y tiempo empleado.
Rara vez un método cumple satisfactoriamente con todos los criterios utilizados para su evaluación, por lo cual, es frecuente y recomendable el uso combinado de diversas técnicas. Usualmente, en primera instancia, se utiliza un método de tipificación quearroje resultados rápidamente, seguido de procedimientos que ofrezcan información mas precisa, pero cuya imple-mentación requiera de mayor tiempo.
proporción de aislados que pueden ser detectados por el método y asig-nados a un tipo particular. Idealmente, un método de de-tección debe permitir la identificación y tipificación de la totalidad de los aislados analizados.
capacidad del procedimiento para arrojar el mismo resul-tado repetidas veces.
Struelens en 1998, establece que la pertinencia y efectividad de un método de tipificación podrá ser evaluada mediante los siguientes criterios:
En los estudios epidemiológicos, la identificación y caracterización de los microorganismos es indispensable. La suma de estos procedimientos se denomina tipificación, y permite establecer la identidad de los microorganismos causantes de un brote infeccioso, contribuyendo a la de-terminación de la fuente de la infección y de los patrones de diseminación. Además, facilitan la evaluación de las medidas de control, mediante la determinación de la preva-lencia, en tiempo y espacio, del agente infeccioso.
Mblgo. Franklin Aguilar Gamboa
para que??.....identificar grupos estrechamente relacionados o divergentes.
Entre los métodos de genotipificación más usados están: