PCR purification

THANK YOU!

PCR product

시약

PCR purification

Gel의 DNA 부분자르기

Sample purification 조건은 두 가지로 구분

a. Dimer Removal Condition:

정제하려는 PCR product가 100 bp ~ 500 kb 크기이고, primer dimer를 제거하고자 할 때 권장되는 조건

b. High Yield Condition: 정제하려는 PCR product가 100 bp 이하인경우, dimer와 상관없이 높은 회수율을 원하거나 5 kb 이상의 큰DNA를 정제할 때 권장되는 조건

녹길 기다린다

Primer dimer란??

Spin column

spin down

PCR시에 primer끼리

결합을 이루어 전기영동 결과 확인을 방해하는 것

Washing

PCR purification 실험과정

Agarose gel 조각으 부터

PCR product를 정제할 때

권장되는 protocol.

PCR reaction mixture로부터

PCR product를 정제할 때

사용되는 protocol.

★주의: 본 실험계획은 바이오팩트의 Gel & PCR purification

systemfor PCR purification을 기초로 구성되어있다.

실험재료: Ethanol (100%, 80%, 70%)

Tabletop centrifuge

목차

대부분의 PCR purification은

PCR product에 시약을 넣어 섞어주거나 Gel의 DNA부분을 잘라 시약을 넣어녹길 기다린 다음 spin column에 넣어 spin down시키는 과정을 거치고 washing으로 salt를 없애주어 DNA를 얻으면 된다.

Ethanol 70%가 100%보다 효과적인 이유

PCR purification??

단백질 내에는 아미노산 사이의 수소 결합이 존재하는데

에탄올은 이 결합 사이에 끼어들어 기존 결합을 깨고 새로 결합을 형성해 단백질 구조 변형을 유도한다.

구조가 변형된 단백질은 불안정한 형태를 가지고 이 과정에서 주변 단백질과 엉킬 수 있습니다.

에탄올은 단백질의 아미노산구조의 수소결합 변형을 일으킨다.

즉 단백질의 외부에만 영향을 미칠수있다.

하지만 70%의 에탄올은 단백질의 결합을 즉시 끊지 못하여 단백질의 구조를 내부에서부터 번형시킬수있다.

1. PCR purification 이란 무엇인가?

PCR purification이란 PCR을 진행하고 난 결과물인 PCR product를 정제하는 실험을 말한다.

이를 통해 PCR product 내의 불순물들을 제거하여

고순도의 DNA fragment를 얻을 수 있다.

2. PCR purification의 과정

Sodium acetate와 ethanol 역할

PCR??

3. 그 원리는 무엇인가?

☆ 1983년에 캐리 멀리스(K. Mullis)에게서 처음 알려졌다.

32164425 조준우

☆ 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)의 약자로서

DNA 중합효소를 이용하여 DNA의 양을 증폭시키는 기술이다.

Ethanol precipitation?

☆ PCR법은 현재 생물학에서 광범위하게 사용되는 기술이다.

분자생물학에서는 DNA나 RNA를 다루기 위해서 반드시 이용되는

매우 중요한 기술로 받아들여지고 있다.

DNA 지문 분석, 인간 유전학, 분류학,

고생물이나 멸종 생물의 DNA를 증폭하기 위해서도 이용된다

소금의 역할은 인산염 골격의 전하를 중화시키는 것이다.

용액에서, 소듐 아세테이트는 Na + 및 [CH3COO]-로 분해된다. 양으로 하전 된 나트륨 이온은 분자를 훨씬 덜 친수성으로 만들어, 따라서 물에 훨씬 덜 용해시킨다.

에탄올 침전은 수용액에서 DNA를 농축하고 탈염하는 데 일반적으로 사용되는 기술입니다.

용액 내 Na + 이온과 PO3- 이온의 정전 기적 인력은

쿨롱의 법칙 에 의해 결정되며 , 이는 용액의 유전 상수에 영향을받습니다.

물은 유전상수가 높기 때문에 Na +와 PO3-를 함께 만들기가 상당히 어렵습니다.

반면에 에탄올은 유전상수가 훨씬 낮으므로 Na +가 PO3-와 상호 작용하고 전하를 보호하며 핵산이 덜 친수성으로 만들어 용액에서 떨어지게됩니다.

32180533 김민석

기본적인 절차는 소금과 에탄올을 수용액에 첨가하여 용액에서 핵산을 침전시키는 것입니다. 침전 후 핵산은 원심 분리에 의해 나머지 용액으로부터 분리 될 수있다.

DNA 정량이란?

핵산이 UV 파장에서 최대 흡수율을 갖기 때문에 260 nm에서 용액 흡광도를 측정하는 것입니다 (A260). A260은 뉴클레오타이드 및 단일 가닥 핵산으로부터 낮은 감도 및 간섭을 겪는다. 또한, 핵산 제조에 일반적으로 사용되는 화합물은 260 nm에서 흡수되어 비정상적으로 높은 정량 수준을 초래한다. 그러나, 이들 간섭 및 제조 화합물은 또한 280 nm에서 흡수하여 A260 / A280에서 비 흡광도 측정을 수행함으로써 DNA 순도를 계산한다.

순수한 DNA는 1.7의 값을 가지며

ss-DNA, RNA는 1.8이상의

값을 보입니다.

등등...

A260/A280

PCR 중.....

따라서 DNA의 순도를 알기위해 DNA정량법을 사용한다.

효소

프라이머

뉴클레오타이드

32184663 최윤서

참고문헌

pcr purification

https://search.yahoo.co.jp/image/search;_ylt=A2Rivb0rRJtdVR4AYSGU3uV7?p=pcr&aq=-1&oq=pcr&ei=UTF-8#mode%3Ddetail%26index%3D62%26st%3D2141

pcr

https://cafe.naver.com/biofactacademy/80

pcr purification

https:/www.youtube.com/watch?v=JY8lFxGoqcE&t=51s

https://ko.wikipedia.org/w/index.php?sort=relevance&search=pcr&title=%ED%8A%B9%EC%88%98:%EA%B2%80%EC%83%89&profile=advanced&fulltext=1&advancedSearch-current=%7B%7D&ns0=1

쿨롱법칙

<a href='https://pngtree.com/so/디자인'>디자인 png from pngtree.com</a>

https://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%BF%A8%EB%A1%B1_%EB%B2%95%EC%B9%99

<a href='https://pngtree.com/so/화학'>화학 png from pngtree.com</a>

증폭된 유전산물을 바로사용하기에는 불순물이 많음!

DNA의 순도를 높여주는 작업필요!

물과 DNA 결합 못하고

물과 에탄올이 결합함

Salt (NA+)

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