Can we use transgenic cats for biomedical research?

¿Podemos utilizar gatos transgénicos en investigación biomédica?

Producción del transgénico

Gametos

Blastocito

Obtención por microdiseción de las gónadas.

Madre de alquiler

¿Como llevarlo a cabo?

Resultados:

• Transferencia nuclear de células somáticas--- expresión proteínas fluorescentes. PERO la eficiencia en la clonación es ↓ y se sufre reprogramación epigenética.

• Los métodos utilizados en ratón tampoco valen: ESC e inyección de ADN en pronúcleos de embriones fertilizados.

• Solución: transmisión de la línea germinal por la microinyección de vectores lentivirales en oocitos o cigotos de una sola célula.

• Tasas de transgénesis altas (>75%)
• La formación del blastocito no difiere entre los microinyectados y los control

• Diferencias nulas en la morfología y desarrollo embrionario entre preFIV y postFIV.

Pandemias del SIDA:

EXCEPTO: reducción del mosaicismo en aquellos microinyectados preFIV.

Estudio:

Utilizado por primera vez en un carnívoro.

• Gatos domésticos
• Humanos

Factores de restricción específicos de cada especie:

• APOBC3
• TRIM

Restringen la actividad de VIF y

VIH-1

Causadas por: LENTIVIRUS

• VIF
• VIH-1

¡Importancia en el desarrollo de un modelo de la enfermedad del VIH!

¿Los embriones de gato son capaces de expresar más de un transgen a partir de un simple paso de microinyección en el espacio perivitelinio del oocito?

microinyección de 418 oocitos

Felis catus

Fecundación in vitro 10h después

tres tipos de vectores:

• GFP
• GFP+RFP
• GFP+factor de restricción TRIMCyp de Macacus rhesus.

• Vector TSinT2AG: un único promotor vírico genérico en forma de proproteína usando el péptido 2A: (hCMV)-promoted rhTRIMCyp-P2A-GFP

• Vector TBDmGpT: usa dos promotores. El PGK para rhTRIMcyp y un promotor mínimo de CMV (mCMV) para GFP. En direcciones opuestas.

Conclusiones y utilidades de la transgénesis por lentivirus en gatos

Resultados:

• 22 embriones transfectados: 5 embarazos + 3 gatos vivos.
• 5 gatos nacieron: 3 vivos + 2 muertos.
• 10 de 11 (fetal o nacido) resultaron transgénicos (elevada tasa).
• El 2º sufrió varios problemas de salud aparentemente no relacionados con el transgene, aunque no se puede excluir esa posibilidad.

• Mejores resultados obtenidos que otras técnicas y posible utilización en la obtención de líneas estables.

TBDmGpt

TSinT2AG

PCR con primers para la secuencia de rhTRIMCyp

• Obtención de gatos uniformes y resistentes al virus.

Digestión y Southern blot del DNA

Expresión del transgen.

Hay 250 patologías hereditarias conocidas que s n comunes en humanos y gat s.

• La intensidad de GFP varía en los tejidos según el gato. Lo mismo ocurre en las PBMCs.

• El 90% de los genes tienen un homólogo en humanos.

• Ambos transgenes se expresaron en todas las células del organismo (“widespread expression”), incluida la línea leucocitaria.

GRACIAS

• >1 inserción x óvulo: puede reducir la dosis administrada.

Características:

• Tamaño intermedio.
• Capacidad de reproducción prolífica.
• Similitud entre sistemas con humanos.
• Abundancia.
• Costes más o menos económicos.
• Complexidad neuroconductual.

Inmunoblot para distintos tejidos del cuerpo.

Utilizaron uno de los gatos que no sobrevivió.

Microscopía de epifluorescencia del miocardio.

• Existencia de ciertos factores que aún desconocemos.

Se realizaron un inmunoblot y un FACS para las PBMCs:

• El FACS determinó un índice de células positivas para GPF del 15 al 80% y se observó como aumentaba gradualmente con la edad.

Los PBMCs de los gatos transgénicos para rhTRIMCyp ofrecían resistencia variable a la replicación del VIF.

• El gato domestico puede suponer un gran potencial para modelizar y conocer más a fondo el VIH-1.

• Todos los gatos expresaron el epítopo de la hemaglutitina (HA) fusionado a rhTRIMCyp, lo que permitió su detección.

• Necesidad de activación previa con interleucina 2 y fitohemaglutinina E para PBMCs.

Transmisión a la línea germinal y expresión del transgénico en la F1.

• Se obtuvo por cruce directo la F1.

• Todos los animales fueron transgénicos.

• No se observó silenciamiento epigenético.

Sí, los gatos transgénicos pueden ser utilizados para la investigación biomédica.

Clara Etchevers Rey

Edgar Perez Matas