Regeneración de apéndices

Basados ​​en estos resultados, Pajcini et al. (2010) plantearon la hipótesis de que las aves y los mamíferos han desarrollado un gen adicional del punto de control del ciclo celular que no está presente en los urodelos, cuyo producto proteico se sinergiza con pRb para suprimir el reingreso del ciclo celular tras la diferenciación de las células musculares.

Tritón

APÉNDICES

REGENERACIÓN EN URODELOS

REGENERACIÓN DE APÉNDICES

Estructuras complejas con tejidos capaces de regenerarse.

• Epidermis, músculos, nervios, cartílagos y hueso.
• En los vertebrados su regeneración es limitada.
• Es común en urodelos (salamadras) y anuros (sapos y ranas).
• Regeneran: Extremidades tempranas y colas.
• Las salamandras son los únicos tetrápodos que regeneran extremidades como adultos.
• Los anuros pierden la capacidad al diferenciarse (cola).
• Los teleósteos pueden regenerar aletas pectorales y colas.
• Algunos mamíferos regeneran: falanges terminales (puntas), cuernos de venado y tejido del oído.

• Las extremidades pueden regenerarse a cualquier nivel de amputación.
• Los tritones y axolotl son las especies más estudiadas.
• Sus extremidades se regeneran vía blastema de células indiferenciadas que forma la zona de amputación.
• Mecanismos simultáneos de regeneración:
• Desdiferenciación y rediferenciación.
• Transdiferenciación y activación de células madre.
• Crecimiento del blastema relacionado a la especificación y rediferenciación de la extremidad.

REGENERACIÓN DE EXTREMIDADES (URODELOS)

Axolotl

FASES DE REGENERACIÓN

¿QUÉ INHIBE LA REGENERACIÓN DE EXTREMIDADES EN RANAS ADULTAS , AVES Y MAMÍFEROS?

La pérdida de regeneración de las extremidades en los renacuajos anuro se asocia con deficiencias espaciales en la expresión génica de patrones.

• La regeneración de un pico de cartílago simétrico en las extremidades amputadas de Xenopus se correlaciona con deficiencias en los patrones de expresión de varios genes.
• El patrón de metilación MFCS1 en los blastemas competentes en la regeneración es específico de cada región, siendo alto en el tejido anterior, pero mucho menor en el tejido posterior que expresa la SHH.

• Los brotes de las extremidades de los renacuajos de los primeros anuros se regeneran perfectamente.
• Los renacuajos tardíos y los renacuajos de algunos anuros no forman blastema, mientras que otros como Xenopus forman un blastema fibroblástico que se diferencian en un pico de cartílago.
• La formación de fibroblastemas se asocia con histólisis subnormal
• Las células satelitales están presentes en las miofibras en el plano de la amputación, pero no se convierten en parte del fibroblastema.

HIPÓTESIS PARA EXPLICAR LA PÉRDIDA DE LA REGENERACIÓN DE RENACUAJOS ANURO

Stocum, 2012

La maduración del sistema inmune suprime la capacidad de regenerar las extremidades

XENOPUS RANA

Etapa 57

XENOPUS RENACUAJO

Etapa 52

Esto quedó demostrado por el hecho de que la piel tomada de un renacuajo temprano competente en la regeneración y preservada en frío fue rechazada cuando se autoinjertó al donante después de su metamorfosis

La primera hipótesis es que a medida que el sistema inmunitario madura durante el desarrollo de ranas, aves y mamíferos y los cogollos de las extremidades se desplazan a una respuesta de regeneración defectuosa que se asocia con una respuesta inflamatoria más intensa a la amputación

Los brotes fetales de ratón tienen una capacidad limitada de regeneración y la piel fetal del ratón se regenera hasta después de la gestación

Si bien podemos correlacionar la falta de verdadera formación de blastema en Xenopus con ciertas deficiencias en comparación con los urodelos, aún no conocemos las razones fisiológicas fundamentales de por qué los urodelos juveniles y adultos y los renacuajos de anuros tempranos son capaces de formar un blastema competente para la regeneración. mientras que los renacuajos de anuros tardíos y los adultos pueden formar solo un blastema deficiente o incompetente para la regeneración. Han surgido dos ideas principales, no mutuamente excluyentes.

Anton Neff

Una relación entre el ciclo celular y la desdiferenciación es deficiente en ranas, aves y mamíferos

La segunda idea es que los urodelos han evolucionado genes específicos de regeneración de extremidades que no se encuentran en ranas, aves y mamíferos que permiten que las células de las extremidades sufran desdiferenciación y se acumulen como un blastema, o ranas, aves y mamíferos han evolucionado para suprimir la regeneración.

La epidermis de la herida se engrosa apicalmente formando el capuchón apical ectodérmico (AEC).

REGENERACIÓN DE APÉNDICES EN MAMÍFEROS

REGENERACIÓN DE CUERNOS DE VENADO

REGENERACIÓN DE OÍDO EN RATONES Y CONEJOS

Vaso sanguíneo regenerado

Nervio regenerado

(A), 24 h después de lanzar la asta.

(B), Blastema 7 días después del lanzamiento el borde de ataque de la epidermis regeneradora. Las líneas de puntos a-a y b-b indican las regiones desde donde se cortaron las secciones..

(C y D), 4 y 8 semanas de crecimiento, respectivamente. (Derecha) Histología de la punta de asta.

Los tejidos músculo-esqueléticos y dérmicos se derivan del blastema rediferenciado en continuidad de los tejidos progenitores.

Regeneración del tejido de la oreja en el ratón MRL frente al ratón de tipo salvaje. (A) El punzón de oreja en el ratón de tipo salvaje de la izquierda solo es parcial, mientras que el punzón de oreja en el ratón MRL se cierra completamente. (B) Las secciones a través de las orejas de tipo salvaje (izquierda) y MRL (derecha) muestran que el borde de la herida de tipo salvaje cicatriza, mientras que se forma un blastema en el borde de la herida de MRL y crece centrípetamente para cerrar la herida. Cortesía de la Dra. Ellen Heber-Katz

Stocum, 2012

(A), sección longitudinal que muestra las zonas del blastema de asta .Epidermis de terciopelo, mesénquima, región progenitora de los condrocitos, cartílago no mineralizado, cartílago mineralizado, hueso

(B), piel de terciopelo. epidermis, dermis, folículo piloso, glándula sebácea.

(C), porción fibrosa del pericondrio, mesenquimal

(D), cartílago no mineralizado.

(E), cartílago hipertrófico.

(F), hueso. La flecha indica osteoblastos, la punta de flecha indica un osteoclasto.

Stocum, 2012

REGENERACIÓN DE LA PUNTA DE LOS DEDOS EN RATONES Y HUMANOS

Células desdiferenciadas se acumulan para formar el blastema de regeneración.

Stocum, 2012

A)A la izquierda, la punta de los dedos de una niña de 7 años amputada en un accidente de bicicleta, se dejó sin suturar y se trató con cambios de apósito. En la derecha punta de los dedos regenerada a las 8 semanas.

(A) Inmediatamente después de la amputación de la falange distal del tercer dedo del pie.

(B) a mitad de camino a través del proceso regenerativo.

(C) La regeneración es completa, con formación de punta de dedo del pie con clavo.

(D) Inmediatamente después de la amputación del tercer dedo del pie a través de la falange proximal.

(E) Varias semanas después, el dedo del pie se ha curado sin regeneración.

Stocum, 2012

B) Puntas regeneradas de los dígitos 3, 4

y 5 de un hombre de 76 años de edad que fueron amputados en un accidente industrial a los 29 años. Las líneas indican nivel de amputación.

Los nervios se regeneran en el blastema.

Se forma una yema cónica parecida a la embrionaria.

Los vasos sanguíneos y los nervios se regeneran por extensión de las partes cortadas preexistentes.

La superficie de la herida se cubre de células epidérmicas

Stocum, 2012

Se han hecho intentos para inducir la formación de blastema en falanges proximales amputadas en ratones y ratas tratando las heridas con tripsina, CaCl2 y soluciones saturadas de NaCl para fomentar la histólisis y la desdiferenciación.

Puntas de dedos de ratón

Nervio progenitor

ESTIMULACIÓN REGENERATIVA DE APÉNDICES EN ANUROS Y MAMÍFEROS

Stocum, 2012

Se han realizado numerosos intentos para mejorar la capacidad de regeneración de las extremidades en los renacuajos, las ranas o las ranas adultas tardías del anuro mediante traumas e irritaciones repetidas para aumentar la histólisis o el aumento del suministro de nervios para aumentar la supervivencia y proliferación de las células del blastema.

Extremidades de ranas

Vaso sanguíneo progentitor

ORIGEN DE LAS CÉLULAS DEL BLASTEMA

MECANISMOS DE PATRÓN DEL BLASTEMA

MECANISMOS DE LA FORMACIÓN DEL BLASTEMA

PROLIFERACIÓN CELULAR DEL BLASTEMA: ROL DE LOS NERVIOS Y LA EPIDERMIS DE LA HERIDA.

La identidad de posición se expresa en la superficie de la célula de blastema.

• Los experimentos de marcado genético mostraron que los diferenciales de adhesivo existen a nivel de una sola célula (Kragl et al., 2009).
• Dependiente de la posición la adhesión de las células en el brote de extremidades en desarrollo y regeneración del renacuajo del Xenopus temprano también ha sido estratificada por la eliminación de células distales y proximales a partir de una mezcla homogénea inicial (Ohgo et al., 2010).

Stocum, 2012

Histólisis

Las discontinuidades estructurales evocan la regeneración intercalar.

El ácido retinoico modifica la identidad posicional en los tres ejes.

• La actividad de este gradiente se demostró in vitro mediante un ensayo de "afinoforesis“
• Se injertaron blastemas de la muñeca, el codo y la parte media del brazo superior en la unión blastema-muñón de las extremidades posteriores que se regeneran de la parte media del fémur. (Fig. 8.22).

Ensayo in vitro de tipo Steinberg (Steinberg, 1978)

Stocum, 2012

• Solo aquellas estructuras distales al plano de amputación se regeneran (la "regla de transformación distal").
• Las células perciben la discontinuidad y proliferan para eliminarla, un proceso llamado regeneración intercalar.
• El desarrollo adicional del blastema se retrasó mientras las células en el nivel proximal del huésped se diferenciaron, con lo cual se reanudó el crecimiento y la diferenciación del blastema compuesto actual

Stocum, 2012

¿Cuáles son las factores axón que estimulan la expresión AGP?

El ácido retinoico cambia el programa de transcripción de las células de blastema de una manera que altera de manera coordinada la adhesividad y la identidad posicional

ACUMULACIÓN DEL BLASTEMA

• GGF-2 (Glial growth factor)
• FGF, PDGF, TGF-B, IL-1, 2, 6 (otros factores de crecimiento producidos por plaquetas y macrófagos)
• KGF ( Keratinocyte growth factor)

• AEC (capuchón apical ectodérmico )
•  El fibroblasto es un tipo de célula residente del tejido conectivo propiamente dicho, ya que nace y muere ahí. Sintetiza fibras y mantiene la matriz extracelular del tejido de muchos animales.
• Pluripotentes : tienen la capacidad de generar casi la totalidad de los tipos de tejidos.
• Fibronectina:La fibronectina (FN) es una proteína ubícua y abundante de la matriz extracelular (ECM) que une otras proteínas de la ECM (colágenos, fibrina, proteoglicanos y FN) y moléculas de adhesión celular (integrinas y sindecanos) regulando, de esta manera, la adhesión, migración, proliferación y supervivencia de las células.

Amputación

El segundo tipo de análisis es comparar la regeneración competente frente a extremidades deficientes.

• La epidermis de la herida y los nervios regeneradores juegan un papel crucial en la proliferación de células blastema.
• Se sabe que estos interactúan para impulsar la acumulación de células blastema

Stocum, 2012

La habilidad de formar células del blastema distingue a la regeneración de apéndices en las taxas.

• Controversia sobre su origen:
• Derivado de los tejidos de la extremidad.
• Derivado de las células sanguíneas de la médula ósea.

• El injerto se desarrolló de acuerdo con su origen, mientras que las células diferenciadas derivadas del nivel proximal del huésped intercalaron las estructuras intermedias entre los niveles de injerto y huésped (Pescitelli y Stocum, 1980; Fig. 8.18).
• Reversión del eje AP o DV mediante el injerto del blastema en el miembro contralateral, o invirtiendo ambos ejes al girar el blastema 180 ° sobre su muñón de miembro, enfrenta polos axiales opuestos de blastema y muñón (Fig. 8.19).

Genes asociados con el patrón de especificaciones

Stocum, 2012

• La presencia de agentes en el tejido neural que promueven la proliferación de las células de blastema se ha demostrado mediante la aplicación de extractos neurales a blastemas cultivadas.
• La proteína es la proteína anterior gradiente (AGP), un ligando para el receptor de la superficie celular blastema Prod1. Prod1 es un miembro de la familia Ly6 de las proteínas de tres dedos ancladas a la superficie celular mediante un enlace glicosilfosfatidil inositol

¿Cuáles son los factores mitogénicos para la proliferación celular del blastema?

• Los Meis 1 y 2 se expresan preferentemente en la región estilopodial de un blastema derivado del brazo
• Hoxd 10, y la expresión de Meis 1 y 2 está aumentada en blastemas distales proximales a RA), mientras que la expresión de Hoxa 13 se reduce.

El crecimiento y diferenciación del blastema es similar en el desarrollo embrionario.

• Depende de las señales del AEC y de los nervios regenerados.

La regeneración es el doble de rápida en estados larvarios que en adultos.

Stocum, 2012

• Células más distal de Schwann de regenerar extremidades tritón a los 5 y 8 días después de la amputación, cuando están en marcha histolysis y desdiferenciación.
• Expresión AGP es abolida por transección del nervio proximal.
• Por 10 días después de la amputación, cuando el blastema acumulación empieza a formar, la expresión de AGP se desplaza a partir de células de Schwann a células de las glándulas secretoras sub-epidérmicas de la AEC.

Stocum, 2012

(A) La expresión del gen de "sonic the hedgehog" en la regeneración de miembros de la extremidad blastemas recapitula que en el desarrollo de las yemas de las extremidades.

(B) La expresión de Shh en el desarrollo y la regeneración de los brotes de las extremidades de Xenopus laevis

• Reprogramación nuclear que altera patrón global por cambio en actividad transcripcional hacia un estado menos diferenciado (actividad de gen de diferenciación es suprimido).
• La inhibición del cambio transcripcional (actinomicina D) no altera histólisis pero si la desdiferenciación de células provocando un retraso en regeneración.
• Los genes regulados al alza durante la formación del blastema son msx1, nrad, rfrng and notch.
• La msx-1 inhibe la miogénesis sin embargo en la desdiferenciación no se encontró ningún efecto en los morfolinos = sigue sin estar claro. La expresión de Nrad se correlaciona con la desdiferenciación muscular y Notch es un importante mediador de la auto renovación de células madre.
• La regulación de la proteína Lin 28 se detectó durante la formación del blastema en la regeneración extremidades axolotl.
• Tambien deben intervenir otros factores para asegurar que las células desdiferenciadas inviertan su programa de transcripción.

Stocum, 2012

El tejido mesodérmico tibia-peroné de las extremidades derecha (R) etapa 52 o etapa 55 fue despojado de la epidermis e injertado en lugar del mesodermo tibia-peroné de la extremidad izquierda (L) con inversión del eje DV. distal, d dorsal (azul), ventral (verde). La epidemia del huésped migra sobre el tejido injertado (flechas)

Stocum, 2012

• Las extremidades de los anfibios es un modelo experimental valioso. Para entender como regenerar los tejidos y estructuras complejas que normalmente no se regenera.
• Se puede hacer 2 tipos de análisis molecular comparativo.
• El primero involucra comparaciones de extremidades y otros tejidos que experimentan una regeneración exitosa dentro del mismo organismos o en diferentes especies de salamandra.

Experimento que muestra el control epidérmico sobre la polaridad DV de las extremidades en regeneración en Xenopus en etapas tempranas de renacuajo cuando la extremidad aún está en desarrollo.

(A) Cartílago GFP es injertado en uno no-GFP. (B) El cartílago GFP es regenerado en cartílago, pero no en músculo.

• Con marcaje mediante GFP, muestra que las células del blastema se originan del músculo, fibroblastos, cartílago.
• Podría existir una transdiferenciación desde fibroblastos dérmicos en condrocitos y tenocitos.
• Las células musculares no pueden transdiferenciarse.

Krag et al, 2009

Señalización de WNT

Patrones del Eje PD

Stocum, 2012

Son un grupo de vías de transducción de señales formadas por proteínas que transfieren las señales del exterior de una célula a través de la superficie receptora de dicha célula hasta su interior. 

Puede ser:

• Vía canónica
• Vía no canónica de polaridad celular
•  Vía no canónica calcificada

Desdiferenciación

La interacción del nervio con la epidermis de la herida es esencial para la formación de blastema.

La interacción neuronal/epidérmica es necesaria para la proliferación de células de blastema

Stocum, 2012

• Tanto el nervio y la capa epidérmica apical son necesarios para la formación de la blastema de acumulación.
• Se reconoce que el mantenimiento de la AEC depende de la inervación mediante la regeneración de axones.
• En una extremidad neurogénica el AEC se forma independientemente del nervio, pero la estructura del AEC no pueden mantenerse a menos que se inerve mediante axones regeneradores.

Diagrama para ilustrar el fallo de la formación de blastema y la falta de regeneración cuando el miembro anterior está denervado (estrella) o privado de epidermis (E), BN nervios braquiales.

Stocum, 2012

• Se sintetiza ADN
• Células de blastema se detienen temporalmente en G2 después de completar la replicación del ADN.
• Evi5, proteína centrosomal
• Una vez formado el blastema de acumulación, entra en una fase de crecimiento donde la mitosis aumenta 10-veces o más.

Stocum, 2012

Las cinco proteínas que intervienen en la señalización de WNT canónica y no canónica son:

• Wnt 8
• APC
• los CCDC88c
• DIXDC1
• Inversin

Celularización de las miofibras no está acoplada a la re-entrada del ciclo celular en las extremidades tritón regeneradoras

Resultados

Blastema establecido es independiente del nervio para la morfogénesis y la diferenciación

Estos resultados sugieren que tanto las vías de Wnt canónicas como las no canónicas pueden regular la formación de blastemas, y son consistentes con el hallazgo de que los genes para ambas vías se expresan en la extremidad de la axolotl regeneradora, y con el hallazgo de que la vía canónica (vía Wnt8) promovió la regeneración de aleta de pez cebra mientras que lavía no canónica lo inhibió.

Cambios en el etiquetado de 3H-T e índice mitótico durante la formación y crecimiento de blastema

Stocum, 2012

Un modelo de formación de patrones APDV

Vía no canónica de polaridad celular

Stocum, 2012

• Utiliza o bien comunicación de célula a célula por cercanía (efecto paracrino) o bien comunicación con la propia célula.
• La liberación paracrina se refiere a un tipo de comunicación celular por secreción química que afecta a una célula vecina a la célula emisora, como es el caso de muchas hormonas

Stocum, 2012

• Inversin y CCDC88c son componentes de la vía de acceso no canónico .Inversin cambia la vía canónica a la vía no canónica dirigiéndose a la proteína desaliñado para la degradación por el proteasoma o por el Activación de lac-JunN-terminalquinasa(JNK)víaalDVL2yaxin
• y CCDC88c es una Nega-tivaregulador de la vía canónica. Ambos estan fuertemente regulados

Dependencia de la morfogénesis distal y la diferenciación en las extremidades regeneradoras del AEC

Vía canónica

Stocum, 2012

Conduce a la regulación de la transcripción génica.

Wnt 8 y APC estaban fuertemente regulados, pero DIXDC1, que es un regulador positivo de la vía canónica

Dependencia de la epidermis de la herida en el nervio para la regeneración de las extremidades se produce debido a la inervación durante el desarrollo.

Hertwig (1927) realizó un injerto de extremidades haploides de T. taeniatus a huéspedes diploides y amputó las extremidades desarrolladas.

• Las células regeneradas siempre eran donadoras de ploidía.

Efecto de la denervación en la síntesis molecular de blastema

Las células del blastema provienen de células maduras que se desdiferencian.

Thornton, 1938 y Hay, 1959; usaron microscopía para estudiar las miofibras de tejidos regenerándose.

• Las células maduras se dividen en células mononucleadas desdiferenciadas y se unen al blastema.

Se desconoce la proporción de células del blastema originadas por células madre vs desdiferenciación.

Las células blastema promueven la regeneración del axón

• A medida que crece el blastema, los axones deben alargarse continuamente para llevar a cabo la última inervación de tejidos diferenciados
• Las células de Schwann proporcionan la mayoría de los factores solubles (factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado del cerebro, factores neurotróficos-3 y -4, factor neurotrófico ciliar y factor neurotrófico derivado del glial)
• El crecimiento de axón es significativamente más vigoroso con el tejido de blastema, sin embargo, lo que sugiere que las células de blastema producen otros factores no identificados que apoyan la supervivencia de las neuronas y el crecimiento axón.

• Las células blastemas son altamente activadas en el ADN, ARN y la síntesis de proteínas durante la regeneración.
• La denervación de la etapa del brote tardía de los tritones adultos redujo la síntesis total de ARN en un 75% en 40 horas después de la denervación
• El análisis autoradigrafico de los miembros de la larva mostro que la síntesis del ARN se inició, luego se desvaneció rápidamente.

Butler y O’Brien (1942) demostraron que las células del blastema se originaban en los tejidos de la extremidad amputada.

• Utilizaron rayos X para impedir la división celular.

Zona blindada: se regenera

Zona expuesta a rayos X: no se regenera.

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Bibliografía

Stocum, 2012

ANÁLISIS COMPARATIVO COMO UNA HERRAMIENTA PARA ENTENDER LA REGENERACIÓN DE EXTREMIDADES.

• Stocum, D. L. (2012). Regeneration of Appendages. Regenerative Biology and Medicine, 183–226. doi:10.1016/b978-0-12-384860-4.00008-3