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ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Engenharia Genética

Atuação de uma endonuclease

Este progresso avassalador da engenharia genética pelo nosso quotidiano exige que se conheçam algumas das suas surpreendentes técnicas, das quais as enzimas de restrição constituem uma ferramenta indispensável.

Como encontrar um determinado gene?

Como separá-lo dos restantes genes?

A enzima Eco Ri reconhece a porção da hélice dupla: 5’GAATTC3’. Ao cindir o DNA entre os nucleótidos de G e A, sempre que encontra esta sequência, origina fragmentos sob a forma de dupla hélice, mas com uma pequena extensão em cada extremidade de DNA em cadeia simples.

Extremidades coesivas

Enzimas de restrição

Atuam em pontos específicos, nas zonas de restrição, catalisando a fragmentação do DNA em porções menores, que contêm nas suas extremidades a sequência que foi reconhecida pela endonuclease.

Tipo II

• 3 subunidades: de restrição, de metilação e de reconhecimento;

• Sequência de reconhecimento palindrómica;

• Hidrólise ocorre dentro ou nas extremidades da sequência reconhecida e não necessita de ATP;

• Importante na recombinação genética e na elaboração de mapas de restrição (especificidade de corte).

Enzimas de restrição

Também designadas de endonucleases e conhecidas por “tesouras moleculares”, são enzimas que fragmentam a dupla hélice do DNA quando encontram uma determinada sequência de pares de bases – palíndromas.

Tipo III

• 2 subunidades: de restrição e de metilação e reconhecimento;

• Sequência de reconhecimento assimétrica;

• Local de hidrólise não específico e necessita de ATP;

• Não é utilizada em Engenharia Genética.

Tipos de enzimas de restrição

Tipo I

Classificação:

• Composição da sequência nucleotídica;

• Posição de clivagem;

• Sequência de reconhecimento;

• Co-fatores envolvidos;

• Estrutura da enzima em causa.

Fatores influenciadores da atividade:

• Temperatura;

• Digestão com múltiplas enzimas.

• 3 subunidades: de restrição, de metilação e de reconhecimento;

• Sequência de reconhecimeto assimétrica;

• Local de hidrólise não específico e necessita de ATP;

• Não é utilizada em Engenharia Genética.

Revolução biotecnológica

Só a partir do século XX, devido aos avanços tecnicocientíficos, foi possível abrir a molécula de DNA, extrair genes e transplantá-los para outras células, multiplicá-los e transformar, em tubo de ensaio, uns organismos noutros.

Enzimas compatíveis

Isosquisómeros

• DNA recombinado com sequência híbrida;

• Sobreposição parcial de sequências de reconhecimento;

• Produzem extremidades coesivas compatíveis.

Exemplo

Endonuclease Sequência de reconhecimento

BamHI 5'G|GATCC3'

3'CCTAG|G5'

Bgll 5'A|GATCT3'

3'TCTAG|A5'

• Diferentes enzimas de restrição possuem a mesma sequência de reconhecimento;

• Diferem nas condições ótimas de reação.

Exemplo

Endonuclease Sequência de reconhecimento

Sacl 5'G|AGCTC3'

3'CTCGA|G5'

Sstl 5'G|AGCTC3'

3'CTCGA|G5'

Vídeos demonstrativos

Aplicações em Engenharia Genética

http://www.iq.usp.br/bayardo/softwares/proteina/advanced/cap3/anim.html

• Deteção da presença de diferentes formas de genes.

• Análise molecular da estrutura dos cromossomas e do genoma;

• Formação de novas combinações de material genético;

• Manipulação e transferência de genes de uma molécula de DNA para outra (técnica do DNA recombinante);

• Caracterização fenotípica de defeitos genéticos hereditários ao nível do DNA;

• Estabelecimento de relacionamentos filogenéticos;

• Proteção bacteriana.

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