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Este progresso avassalador da engenharia genética pelo nosso quotidiano exige que se conheçam algumas das suas surpreendentes técnicas, das quais as enzimas de restrição constituem uma ferramenta indispensável.
A enzima Eco Ri reconhece a porção da hélice dupla: 5’GAATTC3’. Ao cindir o DNA entre os nucleótidos de G e A, sempre que encontra esta sequência, origina fragmentos sob a forma de dupla hélice, mas com uma pequena extensão em cada extremidade de DNA em cadeia simples.
Extremidades coesivas
Atuam em pontos específicos, nas zonas de restrição, catalisando a fragmentação do DNA em porções menores, que contêm nas suas extremidades a sequência que foi reconhecida pela endonuclease.
• 3 subunidades: de restrição, de metilação e de reconhecimento;
• Sequência de reconhecimento palindrómica;
• Hidrólise ocorre dentro ou nas extremidades da sequência reconhecida e não necessita de ATP;
• Importante na recombinação genética e na elaboração de mapas de restrição (especificidade de corte).
Também designadas de endonucleases e conhecidas por “tesouras moleculares”, são enzimas que fragmentam a dupla hélice do DNA quando encontram uma determinada sequência de pares de bases – palíndromas.
• 2 subunidades: de restrição e de metilação e reconhecimento;
• Sequência de reconhecimento assimétrica;
• Local de hidrólise não específico e necessita de ATP;
• Não é utilizada em Engenharia Genética.
Classificação:
• Composição da sequência nucleotídica;
• Posição de clivagem;
• Sequência de reconhecimento;
• Co-fatores envolvidos;
• Estrutura da enzima em causa.
Fatores influenciadores da atividade:
• Temperatura;
• Digestão com múltiplas enzimas.
• 3 subunidades: de restrição, de metilação e de reconhecimento;
• Sequência de reconhecimeto assimétrica;
• Local de hidrólise não específico e necessita de ATP;
• Não é utilizada em Engenharia Genética.
Só a partir do século XX, devido aos avanços tecnicocientíficos, foi possível abrir a molécula de DNA, extrair genes e transplantá-los para outras células, multiplicá-los e transformar, em tubo de ensaio, uns organismos noutros.
• DNA recombinado com sequência híbrida;
• Sobreposição parcial de sequências de reconhecimento;
• Produzem extremidades coesivas compatíveis.
Exemplo
Endonuclease Sequência de reconhecimento
BamHI 5'G|GATCC3'
3'CCTAG|G5'
Bgll 5'A|GATCT3'
3'TCTAG|A5'
• Diferentes enzimas de restrição possuem a mesma sequência de reconhecimento;
• Diferem nas condições ótimas de reação.
Exemplo
Endonuclease Sequência de reconhecimento
Sacl 5'G|AGCTC3'
3'CTCGA|G5'
Sstl 5'G|AGCTC3'
3'CTCGA|G5'
http://www.iq.usp.br/bayardo/softwares/proteina/advanced/cap3/anim.html
• Deteção da presença de diferentes formas de genes.
• Análise molecular da estrutura dos cromossomas e do genoma;
• Formação de novas combinações de material genético;
• Manipulação e transferência de genes de uma molécula de DNA para outra (técnica do DNA recombinante);
• Caracterização fenotípica de defeitos genéticos hereditários ao nível do DNA;
• Estabelecimento de relacionamentos filogenéticos;
• Proteção bacteriana.