PCR-Methode

Künstliche Replikation der DNA

Die PCR-Methode

Real-Time PCR

Habt ihr noch Fragen

Aufgaben

• Real-Time PCR (engl. real-time - Echtzeit)
• Analyse bei Trisomie 21-Risiko
• gleiche Vorbereitung

=> Farbstoff (z.B. SYBR Green)

• Farbstoff bindet an die DNA des 21. Chromosoms

=> Vorteil: sofort Messbar (Quantifizierung)

1. Ein PCR-Zyklus im RG hat Ähnlichkeit mit der DNA-Replikation in Zellen. Begründe.

?

Lösung: enzymatische Snythetisierung des komple-menteren Stranges, Primer werden verwendet, etc.

2. Erläutere die Vorteile der Fluoreszenzsequenzierung gegenüber der Ketten-abbruchmethode.

Seite 54

Aufgabe 1

Lösung: schneller als Autoradiographie und Verwendung ungefährlicher Substanzen.

Unsere Quellen und eure Seiten zum Nachlesen

Grüne Reihe Genetik SII: Seite 53 bis 56

Linder Biologie Gesamtband: Seite 146

Natura Oberstufe: Seite 174/175

PCR-Methode

Temperaturen im Thermocycler:

• Polymerase-Ketten-Reaktion

(engl. Polymerase-Chain-Reaction)

• künstliche Replikation der DNA
• millionenfache in-vitro (lat. im Glas) Vervielfältigung

=> Amplifikation

• unterteilt in 3 Schritte
• Verwendung in der Kriminologie und bei genetischen Krankheiten (Humangenetik)

2. Zyklus

4. Zyklus

1. Zyklus

3. Zyklus

...

PCR-Zyklus

1. Denaturierung

3. Polymerisierung/Elongation

2. Hybridisierung

• Senkung der Temp. auf 68 Grad C.
• Primer binden an dem 5'-Ende der Einzelstränge an

• Vorbereitung: DNA, Primer, Desoxynukleosid-Triphosphate, Taq-Polymerasen (hitzebeständig)

und Pufferlösung

• Erhitzung auf 72 Grad C.
• Taq-Polymerase synthetisiert den neuen Strang in Richtung 5'-3'
• Zyklus wiederholt sich

• Erhitzung auf 96 Grad C.
• H-Brückenbindungen zerstört => Zwei Einzelstränge

5'

n

2 n = Anzahl der Zyklen

3

8

2 =

2 = ?

32

2 =

2 = ?

4 294 967 296

Floureszenz-

sequenzierung

20 - 40 Wiederholungen

• Weiterentwicklung der DNA-Sequenzierung
• ebenfalls Bestimmung der Nukleotid-Abfolge eines DNA-Abschnittes
• Unterschied: Farblich-markierte ddNTP und KEINE spezifischen Primer
• gleicher Ablauf wie bei der DNA-Sequenzierung

Fluorezenz-Detektor am Ende [+-Pol] des Gels

DNA-Sequenzierung

Selber Ablauf wie bei der Kettenabbruchmethode

farblich markierte ddNTP, statt spezifizierte Primer!

Detektor erkennt die ddNTP

Computer zeichnet die Fragmente farblich auf

Die gesuchte Sequenz muss noch ergänzt werden [A-T, G-C]

• Kettenabbruchmethode
• Bestimmung der Nukleotid-Abfolge

eines DNA-Abschnittes

• ähnlicher Vorgang wie bei PCR

=> Unterschiede: einen radioaktiv-

markierten Primer, Abbruch- Nukleoside (ddNTP) als Stoppsignal

PCR-Methode (Denaturierung, Hybridisierung mit radioaktivmarkiertem Primer, Taq-Polymerase)

mehrere Matizenstränge,

Nukleoside und ddNTP

Synthese vom komplemen-tären Strang bis ddNTP

mehrere Doppelstränge mit jeweils unterschiedlicher Länge

erneute Denaturierung in der Gel-Elektrophorese

Stränge mit radioaktivmarkier-tem Primer werden sichtbar, Stränge OHNE spezifischen Primer NICHT sichtbar!

Jonas, Mathis und Justus