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Transcript

Trousseau (1868) - Cuestionó el término "parálisis". consideró a la enfermedad como una corea. Utilizó dinamómetros para medir la fuerza de los pacientes, reportó bradicinesia.

Charcot (1877) - Consideró el temblor al reposo como síntoma fundamental de la enfermedad. Se refirió a la EP como una neurosis.

Blocq y Marinesco (1894) - Reportaron lesiones en la sustancia nigra del cerebro.

Brissaud (1895) - Introdujo el termino "maladie de Parkinson" reportó problemas no motores de la enfermedad.

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

Facultad de Química

Tesis

Búsqueda de mutaciones en siete loci PARK en pacientes con enfermedad de Parkinson mediante la técnica de amplificación de sondas dependientes de ligando

Presenta

Allan Lozano Romero

Asesora: Dra. Nancy Monroy Jaramillo

Trabajo realizado en:

Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía

"Dr. Manuel Velasco Suárez"

Objetivos

Antecedentes

Amplificación de Sondas Dependientes de Ligando (MLPA)

Sylvius de la Böe 1680

Van Swieten 1749

Gaubius 1758

Sauvages 1768

Estudio del temblor como enfermedad y aportación de datos como:

  • Diferenciación de temblor en reposo y movimiento
  • Diferenciación entre temblor sin causa identificada y temblor por consumir bebidas espirituosas

2000 - Desarrollo de los primeros modelos animales en moscas y ratones para estudio de la EP

2003 - Descubrimiento de mutaciones estructurales (triplicaciones) en SNCA causales de EP

2004 - Descubrimiento de mutaciones en LRRK2 causales de EP

2009 - GWAS para la búsqueda de genes de riesgo para EP

2011 - Se identificaron cinco nuevos loci de riesgo para EP

Antes de 1817

1860-1900

2000-...

Estandarizar la técnica de MLPA para tamizar mutaciones en siete loci PARK en pacientes con sospecha de EP

Confirmar los resultados obtenidos con MLPA mediante secuenciación de Sanger o QPCR

Establecer una correlación genotipo- fenotipo en los casos familiares

Método rápido para detectar deleciones, duplicaciones.

También puede detectar mutaciones puntuales

Detección de 43 regiones diferentes de importancia en siete loci PARK asociados a EP

1990-2000

1817

En la actualidad

James Parkinson

Publicación de "An Essay on Shaky Palsy"

La EP es un desorden degenerativo del sistema nervioso, caracterizado por presentar movimientos involuntarios de tipo temblor en reposo, rigidez y bradicinesia. Se le considera una enfermedad multisistémica en la cual varias rutas no dopaminérgicas del sistema motor se ven afectadas de manera progresiva a lo largo de la enfermedad.

1997 - Se descubrieron mutaciones en SNCA causales de EP.

1998 - Se descubrieron mutaciones en PARK2 causales de EP con patrón de herencia autosómico recesivo.

Definición:

"Temblor involuntario con disminución de en la fuerza muscular en miembros en reposo, incluso cuando están apoyados; con propensión a encorvar el tronco hacia el frente, y a pasar de una posición de caminar a una posición de correr: los sentidos y el intelecto no están afectados"

Factores que influyen en el desarrollo de la enfermedad de Parkinson

La EP es el desorden de movimiento más común y la segunda enfermedad neurodegenerativa más frecuente.

1-2% de población mayor de 65 años sufre EP

3-5% de personas mayores de 85 años sufre EP

En la EP se observa una pérdida progresiva de las neuronas dopaminérgicas en los núcleos del tronco cerebral.

El diagnóstico de la EP es principalmente clínico.

Escala unificada para la evaluación de la EP (UPDRS). Cuestionario en 4 partes para la ayuda de los especialistas en desordenes de movimiento.

La confirmación definitiva es posmortem

Scholz, et al. 2013

La EP se puede clasificar por:

Edad de inicio:

EP edad promedio de inicio 60 años

EPIT edad de inicio antes de 45 años

EP juvenil edad de inicio antes de 20 años

Historia familiar:

EP esporádico, la mayoría de los casos

EP con agregación familiar, 10-15% de casos

EP familiar monogénico, 5-10% de casos

Respuesta al tratamiento, velocidad de la evolución de la enfermedad.

6,233,618 mayores a 65 años

703,295 mayores a 85 años

160 000 personas en riesgo de padecer la enfermedad.

En algunos casos se observa la presencia de inclusiones intracelulares de agregados de α-sinucleína llamados cuerpos de Lewy

INEGI, 2010

Actualmente afecta a 4.6 millones de personas mayores a 50 años. En 2030 la cifra será duplicada

Frank, et al. 2006

Antony, et al. 2008

SSA, 2008

Comparación de MLPA con otras técnicas de biología molecular

Conclusiones

Pacientes

Discusión de resultados

Interpretación de resultados

Fundamento MLPA

MLPA

SNCA

Diagrama de dosis relativa control

Electroferograma de un control

PARK2

81 pacientes de 76 familias

Electroferograma paciente E35

Diagrama de dosis relativa E35

  • Las frecuencia de mutaciones es baja y relativamente rara.
  • No se encontraron mutaciones
  • Nuestro equipo de trabajo ha encontrado polimorfismos de riesgo (Dávila, et al. Manuscrito en preparación)
  • MLPA ha demostrado ser una técnica rápida, barata y ofrece un amplio potencial de resultados para EP.
  • Un punto crucial en MLPA es la interpretación de los datos.
  • Los falsos positivos disminuyen si el número de controles autmenta.
  • MLPA no obtiene información intrónica ni de heterocigotos compuestos.
  • MLPA es más sensible a la presencia de contaminantes y degradación de DNA que PCR convencional
  • La frecuencia de mutaciones homocigotas encontradas (2.63%) fue similar a otras poblaciones, 2.7% en población de Corea (Choi, et al. 2008), 2.5% en población de Polonia (Koziorowski, et al. 2009).
  • Las mutaciones heterocigotas son difíciles de asociar con certeza.
  • La proporción de deleciones / duplicaciones (90%, 10%) fue similar a la reportada anteriormente por nuestro equipo de trabajo 93.7% y 6.3% (Guerrero, et al. 2011).

DJ1

Rango de edad:

5 - 81 años

Distribución de género:

47 mujeres y

34 hombres

  • Se comprobó la utilidad de MLPA como técnica de tamizaje de mutaciones estructurales y las principales mutaciones de secuencia en siete loci PARK asociados con EP
  • Los resultados obtenidos por MLPA fueron concordantes con los resultados obtenidos por otras técnicas. MLPA plantea una estrategia para el abordaje primario de pacientes con diagnóstico de EP.
  • Se recomienda utilizar MLPA dentro del proceso básico de búsqueda de mutaciones en pacientes como primer método de tamizaje genético.

63 esporádicos

  • Las mutaciones en DJ1 son raras con frecuencias de 0.4%, en nuestro trabajo fue de 1.3%
  • Las mutaciones en este gen se asocian con demencia, la información del paciente mutado en DJ1 también refiere demencia.

13 familias

Confirmación de resultados

PARK2 exón 4

Mutación puntual LRRK2 p.G2019S

35 AHF+

Caso de mutaciones digénicas PINK1/PARK2

LRRK2

PARK2/PINK1

Las mutaciones digénicas fueron identificadas en una familia de una comunidad de Morelos, con una población aproximada de 1000 habitantes.

Controles

PINK1 exón 6

Aaii

XaXi

F2-1:

  • PARK2Ex4DelHt, PINK1Ex6DupHm
  • edad de inicio 39 años
  • 12 años evolución

aaii

  • La frecuencia de la mutación p.G2019S es alta en ciertas poblaciones especificas. Ejemplo, 40% en árabes del norte de África (Lesage, et al. 2005). Sin embargo para la mayoría de las poblaciones se reporta una prevalencia de 0-2%. Los resultados obtenidos (2.47%) fueron similares y congruentes con resultados previos (Yescas, et al. 2010)
  • La deleción del exón 27 no pudo confirmarse por la falta de cebadores específicos, es necesario hacer la confirmación, sin descartar una posible mutación puntual que evitara una correcta hibridación.

12 personas sanas sin antecedentes de enfermedades neurodegenerativas.

Este es el segundo caso de duplicaciones en PINK1 que se ha descrito por nuestro equipo de trabajo, anteriormente se publicó el primer caso (Monroy-Jaramillo, et al. 2014).

F2-2:

  • PARK2Ex4DelHm, PINK1Ex6DupHm
  • edad de inicio 25 años
  • 4 años evolución

Composición de paneles comerciales

  • Los resultados de este trabajo ofrecen una estrategia rápida que facilita un diagnóstico confirmatorio de EP junto con un tratamiento y seguimiento adecuados.
  • A los pacientes positivos para mutación en loci PARK y a sus familiares se les brindó asesoramiento genético.
  • En los casos estudiados que no presentaron resultado positivo para MLPA, no podemos descartar la presencia de mutaciones de secuencia en los genes analizados o en otro genes no estudiados.

Resultados

De 76 familias incluidas en el estudio se encontraron mutaciones en 15 de ellas (19.73%).

El número de mutaciones encontradas por gen fue:

  • PARK2 diez mutaciones (13.15%): ocho Ht (10.52%) y dos Hm (2.63%)
  • LRRK2 tres mutaciones (3.93%): dos mutaciones puntuales p.G2019S (2.63%) y una deleción del exón 27 (1.3%)
  • DJ1 una mutación (1.3%)
  • PINK1/PARK2 una mutación (1.3%)

Se encontraron seis casos de falsos positivos que representan el 6.41%

Tanto controles como pacientes pertenecen a la población mestizo mexicana y firmaron una carta de consentimiento informado

www.mlpa.com

www.mlpa.com

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