Como la bacteria E. coli podria sintetizar insulina humana?

¿Cómo se hace?

ADN

recombinante

Síntesis de la insulina humana a través de la E. coli

Insulina

Zaraith Carrero

¿Que es la insulina?

Síntesis de insulina

La insulina es como una llave que abre la cerradura de las puertas de la célula del cuerpo para la glucosa

Receptores de insulina

La insulina es una hormona polipeptida de 51 aa producida y secretada por las células betas de los islotes de langerhans

Charles Best

James Collip

Jhon James Rickard Macleod

Frederick Grant Banting

Nicolae Paulescu

Pre-proinsulina

Proinsulina

Insulina

Producción de insulina artificial

Producción de insulina

Método clásico

Fue hasta 1922 cuando se administró por primera vez insulina para tratar la diabetes, concretamente un extracto de hígado de ganado que, debido a las impurezas presentes, producía grandes reacciones alérgicas. Los experimentos avanzaron, intentando encontrar la dosis exacta necesaria para una correcta respuesta del organismo, obteniendo resultados más o menos satisfactorios.

Animales transgénicos

Francis Sanchez

La empresa argentina BioSidus se convirtió en la primera a nivel mundial en producir insulina humana en vacas genéticamente modificadas.

Insulina recombinante

Clonación

Producción

de las dos cadenas

por separado

Francis Sanchez.

Producción

de

pro-insulina

Unión covalente de dos fragmentos de ADN.

Selección de una pequeña molécula de ADN capaz de autoreplicarse.

Vectores

ADN

ligasa

Bacteriofagos

Plásmidos

Cromosomas bacterianos

artificiales

BAC

Traslado del ADN del tubo de ensayo

a la célula huésped

Transformación

1. Choque térmico

2.Electroporacion

¿Por que se usa la E. coli?

1. Genes simples y muy estudiados.

2. Fácil de manipular genéticamente.

3. Bajos costos de cultivo.

4. Altos niveles de producción

Beneficios

1.Son física y químicamente equivalente a la insulina pancreática humana.

2.Produce menos formación de anticuerpos.

3.Su producción es más rápida y se genera en grandes cantidad

Clonación

Selección o identificación de las

células huésped con ADN recombinante.

Marcadores seleccionables

Jhessika Torres.

Ingeniería genética

Insulina con ADN recombinante

En 1978 se consigue obtener la secuencia de insulina humana. Esta secuencia se introduce en el interior de la Escherichia Coli y se consigue que la bacteria produzca insulina. Es decir, con ingeniería genética se trasforma la E. Coli con una fábrica de producción de insulina. La insulina se extrae de las bacterias, se purifica y se vende como medicamento.

En 1982 se comercializa la primer insulina con ADN recombinante, su nombre es Humulina.

La ventaja de esta insulina “humana” es que es fácil mantener la bacteria, se pueden producir grandes cantidades en menor tiempo que la de origen animal y con costos menores. La compatibilidad de la insulina es del 100%.

Cortar el ADN en lugares determinados

Endonucleasas de restricción: Reconocen una secuencia de bases específica en el DNA denominada diana o sitio de restricción, y la cortan hidrolizando un enlace fosfodiéster.

Se encuentran de forma natural en bacterias, con función defensiva.

Procedimientos generales

1. Cortar el ADN en lugares determinados.

2. Selección de una pequeña molécula capaz de autorreplicarse.

3. Unión covalente de dos fragmentos de ADN (ADN recombinante).

4. Traslado del ADN del tubo de ensayo a una célula huésped.

5.Selección o identificación de las células huésped con ADN recombinante.

Enzimas de restricción

Se nombran a partir del organismos del que fueron aisladas, a veces indicando la cepa, más números romanos.

La mayoría reconocen sitios de restricción con 4 o 6 bp.

La acción de la enzima EcoRI lo hace a nivel de la unión entre la guanina y adenina, realizando un corte con una secuencia palindrómica y ambos sitios de rompimiento se hallan colocados simétricamente.

II

I

III

&

ATP

Grandes complejos formados por múltiples subunidades que contienen simultáneamente las actividades endonucleasa y metilasa.

En la misma secuencia de reconocimiento.

25 bp.

Al azar.

1000 bp o mas.

Su utilidad fue demostrada por Daniel Nathans. Las usó por primera vez para desarrollar nuevos métodos para cartografiar y analizar genes y genoma.

ATP

ADN Ligasa

Cataliza nuevos enlaces fosfodiéster

ATP

Extremos cohesivos complementarios

Extremos romos (conectores)

Tipos de cortes

Extremos cohesivos

Extremos romos

Enlaces fosfodiéster opuestos. No hay bases desapareadas.

2 a 4 nucleótidos desapareados en cada extremo.

Frecuencia del lugar de restricción

Tamaño de la secuencia de reconocimiento

Tamaño de los fragmentos

• Digestión parcial
• Endonucleasas mensajeras