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TNT 형성에 Lat-B의 효과
Contents
1.Abstract
2.Meterial&Method
3.Result
4.Disscution
WGA로 염색된 PC12 Cell에
5uM latrunculin-B처리
→TNT 형성이 되지 않았다.
Lat-B는 potent actin polymerization inhibitor.
(=일종의 depolymerase로 작용)
즉, Lat-B를 첨가해주었을때 TNT가 형성되지 않았다는 것은, TNT가 actin으로 구성되어있다는 것을
의미한다.
TNT 연결- 트립신/EDTA 처리 대한 내성
∴ TNT의 구성성분을 확인
Amin Rustom, Rainer Saffrich, Ivanka Markovic,
Paul Walther, Hans-Hermann Gerdes
CELL BIOGOLY 001 TEAM 2 091788 Sung-hye Choi 091809 Dae-young Ko 091818 Su-min Jeong
Cell to cell communication is an important prerequisites for the development and maintenance of multicellular organisms.
So far, various mechanisms for exchanging information between cells including chemical synapse, gap junction, and the plasmodesmata, has been demonstrated. Here, we are trying to explain the de novo formed between the cells that create a complex network, the very delicate nanotube structure. Such a structure facilitates the selective transport of organelles and vesicles, but the flow of small molecules appear to be delayed. Therefore, we present a new biological principle of cell to cell interaction based on the membrane continuity and the movement of organelles.
위와 같은 관찰들로 세포들은 서로 접촉하지 않고도 tunneling nanotube(TNT)라는 연결을 통하여 서로 물질을 주고 받을 수 있으며, 세포막의 성분 역시 TNT를 통해 이동할 수 있는 것으로 나타났다. 그러나 세포질의 수용성 분자들은 이동하지 않았다. 연구팀은 TNT가 세포들 사이에 일반적인 물질 또는 정보교환 수단일 것으로 생각하고 있다. 또한 연구에서 TNT의 물질 이동은 단방향성을 가지고 있다는 것이 밝혀졌다.
연구팀의 이러한 관찰을 통해 TNT가 장기적인 세포 대 세포의 의사소통에서 일어나는 전반적인 세포의 현상을 보여준다는 가능성을 높여준 것이다. 세포들이 막 채널을 통해 작은 막운반체들을 능동적으로 교환할 수 있다는 우리의 발견은 TNT로 연결된 세포들간에 막 연속성을 기반으로 한 세포 대 세포의 의사소통의 새로운 원칙에 대한 증거를 제공한다.
Cells are communicating in variety of way. When one cell secretes signal substances, other cells either recognize and react to the signal substance or exchange substances through the contacting parts. In the case of drosophila, substances are exchanged through the structure named cytoneme, made of actin skeleton.
Dr. Gerdes and researchers of the University of Heidelberg found that cultured cells exchange for organelles through the very fine contacting part named tunneling nanotube(TNT)
In observation of PC12 cells of mouse using a three-dimensional microscopic, they found that cells are attached through extremely fine nano tunnel.
The nano tunnel has a diameter of 50-200um, length is similar to a few cells, and the nano tunnel is including F-action.
TNT is protruding from the cell surface without joint. and growing up as time past, and had a complicated contact with neighboring cells.
To understand the function of TNT, researcher connect the green fluorescent protein to synaptophysin. and they noticed that synaptophysin which exist in the initial step of endosome or endosome-derived fine vesicles moves through TNT.
Cell culture and transfection
PC12 cells(rat pheochromocytoma cells, clone 251)은 10% 태아 송아지 혈청과 5% 말의 혈청으로 보충된 DEME에서 배양되었다. 광학현미경 분석을 위해, PC12 cells은 LabTek™ chambered 4-well 커버글라스 또는 9mm 커버슬립에서 plating되었다.
사용된 cDNA construct는 다음과 같다: pEGFP-f, pEYFP-N1, pßactin-eGFPgammacyto (149), referred to as EGFP-actin, syn-EGFP, pcDNA3-hCgB-EGFP, marker for secretory granules, pEGFP-Mito, marker for mitochondria.
Dye stainings and immunofluorescence labeling
▶ Wheat germ agglutinin(WGA) 염색 : WGA Alexa Fluor ®594 conjuate(1mg/ml)1:300)
▶ LysoTracker TM 염색: LysoTracker Gree DND-26 (100nM 최종 농도).
▶ CellTracker™ solution(20um 최종 농도)도 사용되었다.
▶ 핵 염색 : 4,6-diamino-2-phenylindol-di-hydrochlorid(DAPI, 1:500)
Light Microscopy
고배율, 명시야·형광 비디오현미경은 monochromator-based 이미징 시스템과 함께, Confocal 분석은 100x HCX PL APO 100x/1.40 NA oil objective를 갖춘 Leica SP2 공촛점 현미경을 사용하여 수행되었다. 두 이미징 시스템은 37℃ 가열제어장비 갖췄으며 5% CO2가 공급된다.
Fig.4 PC12 세포 사이의 TNT의 de novo 형성의 분석.
WGA 염색 세포는 5μM latrunculin-B (lat-B)로 표시된 존재와 부재로 분석되었다. 분석은 특이화된 세포의 도말 후에 지정된 timepoint에서 3D 형광 현미경에 의해 수행되었다. 각 timepoint의 정량 분석의 경우, 약 150세포를 묘사한 10영역은 임의로 선택되었으므로 TNT의 개수는 측정되었다. 도말 후의 0.5~2시간 동안의 TNT의 숫자의 큰 증가(8.75배) (A)와 lat-B의 존재에서 배양 1시간 후의 TNT의 부재 (B)를 Note. 각 그래프는 두 독립적인 실험의 가치를 보여준다.
장시간 트립신/EDTA의 처리 후에 세포들은 모이기 시작
각각 접촉이 느슨해져 결국 기질에서 분리.
세포들 사이의 TNT 연결는 유지된다
.
Bar는 20㎛.
WGA로 염색된 PC12 세포
565nm의 빛으로 자극
stretched TNT의 진동(A,B)과 그 이후의 파열(C,D)
Bar, 20um
-위와 같은 관찰들로 세포들은 서로 접촉하지 않고도 TNT라는 연결을 통하여 vesicular cargo 형태로 물질을 주고 받을 수 있다.
-세포막의 성분역시 TNT를 통해 이동할 수 있다.
(CF:세포질의 수용성 분자 들은 이동 하지 않았다.)
-TNT는 세포들 사이의 일반적인 물질 교환 이며 동시에 정보교환의 수단.
-TNT가 장기적인 세포와 세포 사이의 의사소통에서 일어나는 전반적인 세포의 현상 설명 가능
-TNT로 연결된 세포들간의 막 연속성을 기반으로 한 세포와 세포사이의 의사소통이라는
원리에 대한 새로운 증거이다.
HEK293, NRK Cell
Wheat germ agglutinin(WGA)염색
3D 현광 현미경으로 관찰
150nm 직경의 membrane-tube 관찰
Bar,20um