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PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

¿Que és el PCR?

Historia

La reacción en cadena de la polimerasa,conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de la biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis.

Historia

Su objetivo:

La técnica de Biología Molecular tiene como objetivo,

obtener un gran número de copias de un fragmneto de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una sola copía de ese fragmento original, o molde.

Esta técnica sirve para amplificar

un fragmento de ADN;

su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar, con una probabilidad muy alta,virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado.

Esta técnica tiene la capacidad

de amplificar milliones de veces fragmentos pequeños de ADN de hasta 10Kb( 10.000 pares de bases), en un un período de tiempo relativamente corto.

¿Quién lo descubrió?

1993

La reacción en cadena de la polimerasa PCR por sus siglas en inglés: (Polymerase chain reaction) fue

concebida por el Dr. Kary Mullis a principios de la década del 80.

Dr. Kary Mullis

(1944-2019)

El Premio Nobel de Química

En abril de 1983, Kary Mullis da a conocer la técnica de reacción en cadena de la polimerasa, o PCR. Esta técnica ha invadido de tal forma la Biología Molecula, que hoy en día es muy difícil imaginar esta ciencia sin ella.

En 1993, Kary Mrllis recibió por este descubrimiento

el Premio Nobel de Química.

Su primera idea

Su Idea

Según cuenta en su página web (www.karymullis.com), la primera idea surgió

en la medianoche de un

viernes en abril de 1983, conduciendo con su Honda gris entre Cloverdale y Boneville e imaginando la

reacción. La historia completa se encuentra

contada de forma muy poética en su página web.

(Hasta ese momento obtener cantidad

suficiente de ADN puro para realizar

experimentos constituía la etapa limitante. )

La aparición de las enzimas de

restricción en la década del 70 y el

desarrollo de la tecnología del ADN recombinante a fines de los 70 habían

hecho posible la obtención de

fragmentos precisos de ácidos

nucleicos para ser estudiados

en detalle.

Sin embargo, la invención de la reacción en cadena de la

polimerasa produjo un

salto tecnológico,

permitiendo a los investigadores producir

cantidades ilimitadas de ADN específico,

sin depender del clonado de fragmentos d

e ADN en organismos vivos.

Por otra parte la PCR

mostró tanta versatilidad, que año a año se

fueron desarrollando nuevas aplicaciones

y variantes.

Hoy es una herramienta fundamental

en cualqier laboratorio de biología molecular.

ADN

molde

Elementos necesarios para la

PCR

Son 4 elementos básicos :

-1) ADN molde

-2) ADN polimerasa

Cebadores

o primers

-3) cebadores o primers

Materiales

-4) Nucleótidos libres

ADN molde

El ADN a partir del cual queremos obtener una copia del fragmento.

-La concentración del ADN molde en la rección depede de la fuente utilizada

-Se requieren aproximadamente de

300 nanogramos a 1 microgramo

de ADN

genómico.

ADN polimerasa

-Es un enzima capaz de copiar

una secuencia de nucleótidos

ADN polimerasa

-Existe una gran variedad de polimerasas con diferentes capacidades a la hora de trabajar con diferentes temperaturas.

Taq ADN polimerasa

La más habitual es la Taq ADN polimerasa, de la bactería Thermus aquaticus.

(capaz de funzionar a altas temperaturas)

Cebadores o primers

Los cebadores o iniciadores de la reacción son oligonucleótidos cortos (entre 18 y 30 nucleótidos), complementarios a la secuencia

target que se desea amplificar. Se utilizan dos cebadores en cada reacción, cada uno complementario a uno de las hebras del ADN

molde, delimitando la región que se desea amplificar.

Nucleótidos Libres

Desoxirribonúcleótidos de trifosfato (dNTPS)

Nucleótidos libres

Las enzimas ADN polimerasas van a crear una cadena complementaria a la cadena molde mediante la incorporación de estos

-Iones divalentes.

Magnesio(Mg2+), agregado como cloruro de magnesio (MgCl2)

Buffer

otros materiaes

-Iones monovalentes, como el potasio

-ADN polimerasa con temperatura óptima alrededor de 70°

Iones

divalentes

-ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar

Buffer :

Es una solución específica que magnifica la actividad

de la polimerasa y mantiene el pH adecuado para su funcionamento, notmalmente contiene coruro de magnesio.

Iones divalentes :

Actuan como cofactores de la polimerasa, generalmente en forma de cloruro de magnesio (MgCl2)

Mediante el uso de la PCR, una secuencia de ADN se puede amplificar millones o miles de millones de veces y producirá suficientes copias de ADN para que se analicen mediante otras técnicas.

1.HUELLA DIGITAL GENÉTICA

Es una técnica forense que permite identificar a una persona comparando su ADN con el de una muestra obtenida, por ejemplo, de la escena de un crimen. Como la muestra puede ser muy escasa, la PCR permite aumentar la cantidad del ADN amplificando ciertos segmentos polimórficos (variables en la población) para luego separarlos mediante electroforesis, lo que se conoce como 'ADN fingerprint' o huella digital.

Aplicaciones

2.Detección de enfermedades hereditarias

Cada gen en estudio puede ser amplificado fácilmente por PCR, con los partidores adecuados, y luego ser secuenciado, para así determinar si un individuo porta alguna mutación que explica la presencia de una enfermedad o su aparición en el futuro, la que puede ser heredada a sus hijos.

2.DETECCIÓN DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS

3.Comparación de la expresión génica

3.COMPARACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

Al introducir una modificación en la PCR clásica se puede estimar la cantidad de ARN mensajero (mARN) en ciertas condiciones experimentales. Al extraer en ARN total de una célula y con el uso de la transcriptasa inversa (enzima de tipo ADN-polimerasa), se puede producir un ADN complementario (cADN) de todos los mARN o de alguno en particular. Con este cADN se puede hacer una PCR para amplificarlo y facilitar su cuantificación. Esto se conoce como RT-PCR y permite estimar cuanto se expresa uno o varios genes en una célula en una condición de cultivo determinada

imagen

4.Test de paternidad

Amplificando por PCR fragmentos polimórficos (poliformismo: Variedad de forma que presentan los individuos de una misma especie) de ADN de la madre, del niño y de él o los presuntos padres y separándolo mediante electroforesis (una técnica que emplean los cientificos en el laboratorio utilizada para separar el ADN, el ARN, o moléculas o proteínas en base a su tamaño y carga eléctrica), se puede visualizar una serie de segmentos que tiene el niño, que debe compartir con la madre y el padre biológicos

4.TEST DE PATERNIDAD

5. Clonamiento de genes

La PCR es habitualmente usada para amplificar un determinado gen o un

ARN mensajero, que puede introducirse en un vector y luego en un organismo que al duplicarse también duplicará el gen que nos interesa. Así podemos tener una cantidad suficiente de un gen, por ejemplo, para secuenciarlo o producir a gran escala la proteína que este gen codifica.

5.CLONAMIENTO DE GENES

3.Análisis del ADN antiguo

Con la PCR se puede analizar ADN que tiene miles de años de antigüedad, lo que ha permitido estudiar muestras obtenidas desde momias y de restos de animales extintos, como los dinosaurios.

6.ANÁLISIS DEL ADN ANTIGUO

La reacción

La reacción se divide en 3 partes,

cada una realizada a una temperatura diferente y que se repite de manera cíclica un número de veces que el experimentador establece según sus necesidades.

Desnaturalización

Anillado

Extención

Cómo funciona

Máquina utilizada

Para que la reacción ocurra rápidamente y de manera correcta se introduce la probeta en una máquina que puede cambiar la temperatura en su interno muy rápidamente y por un número de veces igual al número de ciclos deseados, por esta razón se llama termociclador.

Desnaturalización

En el experimiento que vamos a simular una mezcla de moléculas de ADN contenente la secuencia de nucleótidos que hay que aumentar en cuantidad , o sea la secuencia target .Se toma una probeta con una molécula de ADN que contiene esta secuencia .Esta fase , que se llama desnaturalización provee la separación de las dos hebras que componen el ADN aumentando le temperatura hasta 94°-96°C.

PRIMERA ETAPA

Anillado o Annealing

Apenas se separan las hebras , la temperatura en el termociclador se baja hasta 50°-60°C,para crear las condiciones favorables al proceso de unión de los primers a las regiones de ADN. Aquí se encuentran las bases complementarias a las cuales se pueden emparejar y que señalan el inicio de la secuencia target que se quiere amplificar.

SEGUNDA ETAPA

La extención

En este paso , la enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios

a partir del extremo 3' libre de la región en que se ha hibridado. La temperatura a la que se lleva a cabo esta fase depende de la enzima polimerasa empleada, si se utiliza TAQ polimerasa la temperatura suele ser de 72°C.Esta enzima tiene la particular carácteristica de ser termoestable, esta no se arruina,o mejor no se desnaturaliza, a estas temperaturas

TERCERA ETAPA

Segundo ciclo

Durante el ciclo sucesivo se repiten los mismos pasos. Al final del segundo ciclo se producen 4 moléculas de ADN parcialmente a doble hebra y que contienen la secuencia target.

SEGUNDO CICLO

Tercer ciclo

Se separan otra vez las hebras de ADN elevando la temperatura.Los primers se van a emparaejar a la secuencia target y la encima TAQ polimerasa va areplicar ADN. Al término del tercer ciclo se producen 2 moléculas de ADN a doble hebra que tienen solamente la secuencia target y 6 dobles hebras de secuencias de otro tipo.En los ciclos siguientes las moléculas de ADN contenentes la secuencia target aumentarán exponencialmente.

TERCER CICLO

Cuarto ciclo y los restantes

Durante este ciclo se repiten los

mismo pasos.Finalmente se producen 8 copias de ADN a doble hebra que contienen solo la secuencia target y 8 copias constituidas por hebras más largas.

Al final de 30 ciclos el número de secuencias target presente en la mezcla será en el orden de centenares de millones, mientras la cuantidad de copias no target será igual a 60 moléculas , esto significa que el producto final será constituido virtualmente de solamente ADN contenente la secuencia target.

CUARTO CICLO

Cuarto ciclo

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