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Hoy en día existe un creciente interés por investigar el estrés oxidativo y a los antioxidantes, esto debido a su gran relevancia en relación con las enfermedades que día a día se hacen más incidentes y afectan a la población.
Los antioxidantes son los encargados de mantener el equilibrio contra los oxidantes, actuando como reductores. Por su lado el cuerpo humano es capaz de actuar frente al desequilibrio y defenderse del estrés oxidativo.
-superóxido dismutasa (SOD)
-catalasa
-peroxidasas
Por lo general, las enzimas antioxidantes proporcionan la mayor defensa antioxidante, pero aun así todos los antioxidantes son importantes para la neutralización adecuada del estrés oxidativo.
Amitava Dasgupta, Klein K. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements [Internet]. Fisrt Edit. San Diego: Elsevier Inc.; 2014. 344 p. Available from: https://www.sciencedirect.com/book/9780124058729/antioxidants-in-food-vitamins-and-supplements#book-description
La astaxantina (3,3'-dihidroxi-β-caroteno-4,4'-diona) es un pigmento rojo carotenoide de xantofila responsable del tono rojizo de ciertos animales marinos y crustáceos. La fuente natural abundante de astaxantina es la microalga clorofita, Haematococcus pluvialis. La fuente principal de astaxantina es H. pluvialis y la FDA ha certificado la preparación de astaxantina de H. pluvialis por Fuji Chemical Industry Co., Japón en 2010 como "generalmente reconocida como segura".
1. Anuradha C V. Astaxanthin, a Marine Carotenoid Against Hepatic Oxidative Stress: a Systematic Review [Internet]. The Liver. Elsevier Inc.; 2018. 211-228 p. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/B9780128039519000185
Haematococcus pluvialis es una microalga unicelular de agua dulce distribuida en muchos hábitats en todo el mundo. Actualmente es considerada como la mejor fuente natural de astaxantina y el principal microorganismo productor de este producto comercial.
Shah MMR, Liang Y, Cheng JJ, Daroch M. Astaxanthin-Producing Green Microalga Haematococcus pluvialis: From Single Cell to High Value Commercial Products. Front Plant Sci [Internet]. 2016;7:531. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27200009
1. Rock L, Brunswick N. Standardized Methods for the Determination of Antioxidant Capacity and Phenolics in Foods and Dietary Supplements. 2005;4290–302.
1993 Guohua Cao, et. al.
Ensayo de la capacidad de absorbancia del radical oxígeno
ORAC
ORAC-L
ORAC-H
El ensayo de la capacidad de absorbancia del radical de oxígeno (ORAC), se lleva a cabo en un sistema acuoso.
Huang et. al
β-ciclodextrina metilada
Evaluar el efecto antioxidante del extracto de la microalga Haematococcus pluvialis, usando el ensayo ORACFL y su modificatoria para antioxidantes lipofílicos ORAC-L.
1. Diseñar y construir fotobiorreactores para el cultivo de microalgas en el laboratorio.
2. Purificar y cultivar la microalga Haematococcus pluvialis en condiciones de estrés.
3. Realizar pruebas preliminares del ensayo ORAC para desarrollar el ensayo ORAC-H y ORAC-L.
4. Evaluar la capacidad antioxidante utilizando los ensayos: ORAC-H y ORAC-L, de los extractos obtenidos a partir de microalgas.
Dado que la microalga Haematococcus pluvialis, tiene en su composición potentes antioxidantes, es probable que la capacidad antioxidante de estos pueda ser evaluada por el ensayo ORACFL adaptado a un termociclador para PCR en tiempo real.
Laboratorios H-202 (Laboratorio del Proyecto Mercurio), H-203 y H-401 (Laboratorio de Neurociencia y Biología Molecular), Laboratorios de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas Bioquímicas y Biotecnológicas.
Se hizo el diseño preliminar del biorreactor a construir, el cual está constituido por 3 partes básicas: un vessel (recipiente de contenido), dos HP (head plates) y 4 puertos.
-Buffer fosfato
-Stock de Fluoresceina
-Stock de Trolox
La capacidad antioxidante se expresa generalmente como equivalentes Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico). Trolox es un análogo de la vitamina E, pero soluble en agua, que es un excelente antioxidante.
AAPH
Fluoresceina
Trolox
Cao G, Alessio H, Cutler R. Oxygen radical absorption capacity assay for antioxidants. Free Radic Biol Med. : p. 303-311.
Dasgupta , Klein. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. Primera ed. San Diego: Elsevier; 2014.
ORAC-H
Se prepara previamente una solución de RMCD al 7% (p/v) diluida en una solución de agua-acetona (1:1), seguidamente se sigue el mismo procedimiento antes descrito y se colocan todos los tubos preparados en un shaker para tubos Eppendorf por 1 hora a 400 RPM. Finalmente se continua con el cargado de pocillos y lectura de estos.
Preparación del medio BG-11
4 Stocks
1 LITRO
-10 mL Stock 1
-10 mL Stock 2
-10 mL Stock 3
-1 mL Stock 4
-1.5 g Nitrato de sodio
-0.02 g Carbonato de sodio
-Acetato de etilo - etanol
-Acetona
-DMSO
-Ensayo ORAC en el termociclador para PCR en tiempo real: Realplex2
-Ensayo ORAC en el lector de placas Varioskan LUX.
-Ensayo ORAC-L para el BHA
-Pruebas preliminares de ensayo ORAC-L de diferentes extractos antioxidantes de Haematococcus pluvialis
-Conteo celular
-Absorbancia (688nm)
-Biomasa
1 - Acetato de etilo - Etanol
2-Acetona
3-DMSO
Ensayo ORAC en el termociclador Realplex2
Ensayo ORAC en el lector de placas Varioskan LUX.
Ensayo ORAC en el lector de placas Varioskan LUX.
Ensayo ORAC para el BHA
ORAC-L, DMSO, H. pluvialis
ORAC-L, DMSO, Microalgas verdes
ORAC-H, DMSO, H. pluvialis y microalgas verdes
ANOVA:
Si existe diferencia estadísticamente significativa (al 95% de confiabilidad), esto al ver que el valor F obtenido es mayor que el valor de la probabilidad (ambos datos resaltados en amarillo)
Pero, ¿Qué grupos hacen la diferencia?
Tukey
Tukey
De lo obtenido en la Tabla 12 se puede deducir que los 3 grupos (Tablas 6, 7 y 8) son los que generan la diferencia estadística. Esto porque se puede ver que el valor HSD es superado por los valores de las restas de las medias en comparación de grupos.
Primera. Se diseño y se construyó 3 fotobiorreactores para el crecimiento y desarrollo de diferentes cepas de microalgas. Asimismo, se pudo lograr obtener curvas de crecimiento donde se puede ver el desarrollo de la cepa con las que se trabajó.
Segunda. Se logro purificar la cepa de Haematococcus pluvialis, si bien es cierto existió dificultad para la purificación de esta cepa para su posterior cultivo en los fotobiorreactores, se pudo trabajar, aislar y estresar en medios sólidos de medio BG-11, obteniendo al cabo de 2 semanas cepas estresadas, con las cuales se continuo con el trabajo. Así mismo se logró obtener 3 extractos con diferentes solventes (acetato de etilo-etanol, acetona y DMSO), siendo el extracto con DMSO, el que presento mayor capacidad antioxidante.
Tercera. Se pudo hacer pruebas preliminares donde se comparó el funcionamiento de los equipos: Realplex2 y Varioskan LUX, para realizar el ensayo ORAC. Observándose que el primer equipo mencionado presenta ciertas limitaciones, lo que lo impide obtener resultados adecuados. Por el contrario, el Varioskan LUX muestra resultados óptimos con los cuales se pudo continuar la presente investigación. Se pudo reproducir el ensayo ORAC-H y ORAC-L, obteniendo resultados satisfactorios en estas pruebas. El BHA presentó capacidad antioxidante el cual pudo mostrarse utilizando el ensayo ORAC-L. La introducción de la molécula de RMCD al ensayo para la solubilización de antioxidantes lipofílicos jugo un rol importante en esta investigación, ya que permitió no solo reproducir en ensayo ORAC-L si no también poder determinar la capacidad antioxidante de extractos de microalgas.
Cuarta. Se logró evaluar la capacidad antioxidante de los extractos de la microalga H. pluvialis con acetato de etilo-etanol y acetona, los cuales no presentaron ninguna capacidad antioxidante. Por otro lado, los extractos de la microalga H. pluvialis con DMSO muestra capacidad antioxidante con un promedio de 9690 equivalentes Trolox (µM) por cada mililitro de extracto, por otro lado, los extractos de las microalgas obtenidas luego del funcionamiento de los biorreactores también muestran capacidad antioxidante, pero inferior al valor anteriormente mencionado, con un promedio de 5213.33 equivalentes Trolox (µM) por cada mililitro de extracto. Los mismos extractos al ser evaluados con el ensayo ORAC-H muestran una capacidad antioxidante reducida (2987.33 equivalentes Trolox (µM) por cada mililitro de extracto), esto debido quizá a que ambos extractos tienen una presencia importante de antioxidantes lipofílicos los cuales no interactúan adecuadamente con el medio acuoso del ensayo ORAC-H.
Primera. Se recomienda continuar con los trabajos de aislamiento de la cepa de la microalga Haematococcus pluvialis, por lo observado durante este trabajo de investigación no hay lugar en la ciudad de Arequipa donde se pueda encontrar una cepa totalmente pura y asilada de esta microalga.
Segunda. Se recomienda continuar con el trabajo del ensayo ORAC, para esto se aconseja lo siguiente:
-Estandarizar la técnica ORAC-H.
-Adquirir los dispensadores del equipo Varioskan LUX, esto podría no solo agilizar el trabajo, sino también suprimir el error humano al pipetear.
-Adquirir reservorios para el uso de la micropipeta multicanal.
-Adquirir placas de pocillos con bordes oscuros para evitar el contacto con la luz externa de las muestras.
-Doctor Jose Villanueva Salas
-Maestra Julitza Paredes Fuentes
-Miembros de los laboratorios: Proyecto Mercurio y Neurociencia y Biologia Molecular de la F.C.F.ByB.
-Doctora Graciela Pavon-Djavid de la Universidad de Paris XIII.
-Ingeniero Edilberto Medina de la TUM