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UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA.

Facultad de Ciencias Farmacéuticas Bioquímicas y Biotecnológicas.

Escuela Profesional de Ingeniería Biotecnológica.

“Evaluación de la capacidad antioxidante del extracto de la microalga Haematococcus pluvialis, por el ensayo ORAC-FL en el lector de placas Varioskan LUX”

Tesis presentada por el Bachiller:

Johnson Corrales, Fabrizio.

Para optar el Título Profesional de:

Ingeniero Biotecnólogo.

Asesora: Maestra Paredes Fuentes, Julitza.

Arequipa - Perú

2018

Introducción

Hoy en día existe un creciente interés por investigar el estrés oxidativo y a los antioxidantes, esto debido a su gran relevancia en relación con las enfermedades que día a día se hacen más incidentes y afectan a la población.

Introducción

Antioxidantes

Antioxidantes

Los antioxidantes son los encargados de mantener el equilibrio contra los oxidantes, actuando como reductores. Por su lado el cuerpo humano es capaz de actuar frente al desequilibrio y defenderse del estrés oxidativo.

-superóxido dismutasa (SOD)

-catalasa

-peroxidasas

Por lo general, las enzimas antioxidantes proporcionan la mayor defensa antioxidante, pero aun así todos los antioxidantes son importantes para la neutralización adecuada del estrés oxidativo.

Amitava Dasgupta, Klein K. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements [Internet]. Fisrt Edit. San Diego: Elsevier Inc.; 2014. 344 p. Available from: https://www.sciencedirect.com/book/9780124058729/antioxidants-in-food-vitamins-and-supplements#book-description

Astaxantina

La astaxantina (3,3'-dihidroxi-β-caroteno-4,4'-diona) es un pigmento rojo carotenoide de xantofila responsable del tono rojizo de ciertos animales marinos y crustáceos. La fuente natural abundante de astaxantina es la microalga clorofita, Haematococcus pluvialis. La fuente principal de astaxantina es H. pluvialis y la FDA ha certificado la preparación de astaxantina de H. pluvialis por Fuji Chemical Industry Co., Japón en 2010 como "generalmente reconocida como segura".

Astaxantina

1. Anuradha C V. Astaxanthin, a Marine Carotenoid Against Hepatic Oxidative Stress: a Systematic Review [Internet]. The Liver. Elsevier Inc.; 2018. 211-228 p. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/B9780128039519000185

Haematococcus pluvialis

Haematococcus pluvialis

Haematococcus pluvialis es una microalga unicelular de agua dulce distribuida en muchos hábitats en todo el mundo. Actualmente es considerada como la mejor fuente natural de astaxantina y el principal microorganismo productor de este producto comercial.

Shah MMR, Liang Y, Cheng JJ, Daroch M. Astaxanthin-Producing Green Microalga Haematococcus pluvialis: From Single Cell to High Value Commercial Products. Front Plant Sci [Internet]. 2016;7:531. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27200009

Capacidad antioxidante

Capacidad antioxidante

1. Rock L, Brunswick N. Standardized Methods for the Determination of Antioxidant Capacity and Phenolics in Foods and Dietary Supplements. 2005;4290–302.

Ensayo ORAC

1993 Guohua Cao, et. al.

Ensayo de la capacidad de absorbancia del radical oxígeno

ORAC

ORAC-L

ORAC-H

El ensayo de la capacidad de absorbancia del radical de oxígeno (ORAC), se lleva a cabo en un sistema acuoso.

Huang et. al

β-ciclodextrina metilada

Objetivos

Evaluar el efecto antioxidante del extracto de la microalga Haematococcus pluvialis, usando el ensayo ORACFL y su modificatoria para antioxidantes lipofílicos ORAC-L.

Objetivos

Objetivos secundarios

1. Diseñar y construir fotobiorreactores para el cultivo de microalgas en el laboratorio.

2. Purificar y cultivar la microalga Haematococcus pluvialis en condiciones de estrés.

3. Realizar pruebas preliminares del ensayo ORAC para desarrollar el ensayo ORAC-H y ORAC-L.

4. Evaluar la capacidad antioxidante utilizando los ensayos: ORAC-H y ORAC-L, de los extractos obtenidos a partir de microalgas.

Objetivos secundarios

Hipótesis

Dado que la microalga Haematococcus pluvialis, tiene en su composición potentes antioxidantes, es probable que la capacidad antioxidante de estos pueda ser evaluada por el ensayo ORACFL adaptado a un termociclador para PCR en tiempo real.

Materiales y métodos

Materiales y métodos

Materiales

Materiales

Laboratorios H-202 (Laboratorio del Proyecto Mercurio), H-203 y H-401 (Laboratorio de Neurociencia y Biología Molecular), Laboratorios de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas Bioquímicas y Biotecnológicas.

Métodos

Diseño de los fotobiorreactores "air-lift"

Se hizo el diseño preliminar del biorreactor a construir, el cual está constituido por 3 partes básicas: un vessel (recipiente de contenido), dos HP (head plates) y 4 puertos.

Diseño de los fotobiorreactores “air-lift”

Ensayo ORAC

-Buffer fosfato

-Stock de Fluoresceina

-Stock de Trolox

Ensayo ORAC

ORAC

ORAC

La capacidad antioxidante se expresa generalmente como equivalentes Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico). Trolox es un análogo de la vitamina E, pero soluble en agua, que es un excelente antioxidante.

AAPH

Fluoresceina

Trolox

Cao G, Alessio H, Cutler R. Oxygen radical absorption capacity assay for antioxidants. Free Radic Biol Med. : p. 303-311.

Dasgupta , Klein. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. Primera ed. San Diego: Elsevier; 2014.

ORAC

ORAC

ORAC-H

ORAC-H

ORAC-L

Se prepara previamente una solución de RMCD al 7% (p/v) diluida en una solución de agua-acetona (1:1), seguidamente se sigue el mismo procedimiento antes descrito y se colocan todos los tubos preparados en un shaker para tubos Eppendorf por 1 hora a 400 RPM. Finalmente se continua con el cargado de pocillos y lectura de estos.

ORAC-L

Construcción de los fotobiorreactores “air-lift”

Fotobiorreactores

Cultivo de la microalga Haematococcus pluvialis

Preparación del medio BG-11

4 Stocks

1 LITRO

-10 mL Stock 1

-10 mL Stock 2

-10 mL Stock 3

-1 mL Stock 4

-1.5 g Nitrato de sodio

-0.02 g Carbonato de sodio

Cultivo de la microalga Haematococcus pluvialis.

Aislamiento y obtención de quistes de Haematococcus pluvialis

Cultivo de la microalga Haematococcus pluvialis

Aislamiento y obtención de quistes de Haematococcus pluvialis

Cultivo de la microalga Haematococcus pluvialis

Obtención de extractos

-Acetato de etilo - etanol

-Acetona

-DMSO

Preparación del equipo

Preparación del equipo

Pruebas preliminares

-Ensayo ORAC en el termociclador para PCR en tiempo real: Realplex2

-Ensayo ORAC en el lector de placas Varioskan LUX.

-Ensayo ORAC-L para el BHA

-Pruebas preliminares de ensayo ORAC-L de diferentes extractos antioxidantes de Haematococcus pluvialis

Pruebas preliminares

Resultados y discusión

Resultados y discusión

Curvas de crecimiento

Curva de crecimiento después del uso de los fotobiorreactores.

-Conteo celular

-Absorbancia (688nm)

-Biomasa

Curva de crecimiento después del uso de los fotobiorreactores - Conteo celular.

Curva de crecimiento después del uso de los fotobiorreactores - Absorbancia.

Curva de crecimiento después del uso de los fotobiorreactores - Biomasa.

Curva de crecimiento después del uso de los fotobiorreactores.

Obtención de quistes

Aislamiento de la cepa de Haematococcus pluvialis y obtención de quistes.

Obtención de extractos

Obtención de extractos

1 - Acetato de etilo - Etanol

2-Acetona

3-DMSO

Pruebas prelimianres

Pruebas preliminares

Ensayo ORAC en el termociclador Realplex2

Pruebas preliminares

Ensayo ORAC en el lector de placas Varioskan LUX.

Pruebas preliminares

Ensayo ORAC en el lector de placas Varioskan LUX.

Pruebas preliminares

Ensayo ORAC para el BHA

Ensayo ORAC-H y ORAC-L, DMSO

Ensayo ORAC de extractos obtenidos

Ensayo ORAC-H y ORAC-L de extractos de microalgas con DMSO

ORAC-L, DMSO, H. pluvialis

ORAC-L, DMSO, Microalgas verdes

ORAC-H, DMSO, H. pluvialis y microalgas verdes

Resultados en equivalentes Trolox por cada mililitro de extracto, la sección roja corresponde al extracto obtenido con células de H. pluvialis (ORAC-L), la sección verde al extracto obtenido con microalgas (ORAC-L) y la seccion azul al ORAC-H.

Analisis de datos

Análisis de datos obtenidos.

ANOVA:

Si existe diferencia estadísticamente significativa (al 95% de confiabilidad), esto al ver que el valor F obtenido es mayor que el valor de la probabilidad (ambos datos resaltados en amarillo)

Pero, ¿Qué grupos hacen la diferencia?

Tukey

Análisis de datos obtenidos.

Tukey

De lo obtenido en la Tabla 12 se puede deducir que los 3 grupos (Tablas 6, 7 y 8) son los que generan la diferencia estadística. Esto porque se puede ver que el valor HSD es superado por los valores de las restas de las medias en comparación de grupos.

Límites de detección

Límites de detección

Límites de detección

Conclusiones

Conclusiones

Primera

Conclusiones

Primera. Se diseño y se construyó 3 fotobiorreactores para el crecimiento y desarrollo de diferentes cepas de microalgas. Asimismo, se pudo lograr obtener curvas de crecimiento donde se puede ver el desarrollo de la cepa con las que se trabajó.

Segunda

Conclusiones

Segunda. Se logro purificar la cepa de Haematococcus pluvialis, si bien es cierto existió dificultad para la purificación de esta cepa para su posterior cultivo en los fotobiorreactores, se pudo trabajar, aislar y estresar en medios sólidos de medio BG-11, obteniendo al cabo de 2 semanas cepas estresadas, con las cuales se continuo con el trabajo. Así mismo se logró obtener 3 extractos con diferentes solventes (acetato de etilo-etanol, acetona y DMSO), siendo el extracto con DMSO, el que presento mayor capacidad antioxidante.

Tercera

Conclusiones

Tercera. Se pudo hacer pruebas preliminares donde se comparó el funcionamiento de los equipos: Realplex2 y Varioskan LUX, para realizar el ensayo ORAC. Observándose que el primer equipo mencionado presenta ciertas limitaciones, lo que lo impide obtener resultados adecuados. Por el contrario, el Varioskan LUX muestra resultados óptimos con los cuales se pudo continuar la presente investigación. Se pudo reproducir el ensayo ORAC-H y ORAC-L, obteniendo resultados satisfactorios en estas pruebas. El BHA presentó capacidad antioxidante el cual pudo mostrarse utilizando el ensayo ORAC-L. La introducción de la molécula de RMCD al ensayo para la solubilización de antioxidantes lipofílicos jugo un rol importante en esta investigación, ya que permitió no solo reproducir en ensayo ORAC-L si no también poder determinar la capacidad antioxidante de extractos de microalgas.

Cuarta

Conclusiones

Cuarta. Se logró evaluar la capacidad antioxidante de los extractos de la microalga H. pluvialis con acetato de etilo-etanol y acetona, los cuales no presentaron ninguna capacidad antioxidante. Por otro lado, los extractos de la microalga H. pluvialis con DMSO muestra capacidad antioxidante con un promedio de 9690 equivalentes Trolox (µM) por cada mililitro de extracto, por otro lado, los extractos de las microalgas obtenidas luego del funcionamiento de los biorreactores también muestran capacidad antioxidante, pero inferior al valor anteriormente mencionado, con un promedio de 5213.33 equivalentes Trolox (µM) por cada mililitro de extracto. Los mismos extractos al ser evaluados con el ensayo ORAC-H muestran una capacidad antioxidante reducida (2987.33 equivalentes Trolox (µM) por cada mililitro de extracto), esto debido quizá a que ambos extractos tienen una presencia importante de antioxidantes lipofílicos los cuales no interactúan adecuadamente con el medio acuoso del ensayo ORAC-H.

Recomendaciones

Recomendaciones

Recomendaciones

Primera. Se recomienda continuar con los trabajos de aislamiento de la cepa de la microalga Haematococcus pluvialis, por lo observado durante este trabajo de investigación no hay lugar en la ciudad de Arequipa donde se pueda encontrar una cepa totalmente pura y asilada de esta microalga.

Primera

Recomendaciones

Segunda

Segunda. Se recomienda continuar con el trabajo del ensayo ORAC, para esto se aconseja lo siguiente:

-Estandarizar la técnica ORAC-H.

-Adquirir los dispensadores del equipo Varioskan LUX, esto podría no solo agilizar el trabajo, sino también suprimir el error humano al pipetear.

-Adquirir reservorios para el uso de la micropipeta multicanal.

-Adquirir placas de pocillos con bordes oscuros para evitar el contacto con la luz externa de las muestras.

Agradecimientos

-Doctor Jose Villanueva Salas

-Maestra Julitza Paredes Fuentes

-Miembros de los laboratorios: Proyecto Mercurio y Neurociencia y Biologia Molecular de la F.C.F.ByB.

-Doctora Graciela Pavon-Djavid de la Universidad de Paris XIII.

-Ingeniero Edilberto Medina de la TUM

Agradecimientos

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