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TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
BMC
1. Técnicas de hibridación según el medio
Las técnicas de hibridación se pueden clasificar tomando como criterio el medio soporte en que se llevan a cabo.
A partir de este criterio podemos diferenciar 3 grupos de técnicas:
- En soporte
- En medio líquido
- In situ
1. Técnicas de hibridación según el medio
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO
Se caracterizan porque 1 de las 2 moléculas implicadas, la secuencia diana o la sonda, se inmovilizan sobre un soporte sólido previo a la hibridación.
- Lo habitual es fijar al soporte la muestra que contiene la secuencia diana e incubar posteriormente con la sonda marcada para formar el híbrido.
En esta metodología se basan las técnicas de:
- Southern blot
- Northern blot
- Dot blot
- En otras ocasiones se obtiene más información fijando al soporte la sonda e incubando posteriormente con el ácido nucleico que se estudia, previamente marcado.
En esta metodología se basan, por ejemplo los microarrays.
Conceptos Básicos
Si se trata de ADN, la técnica se llama SOUTHERN BLOT. Una vez transferido, se utilizan sondas de ADN para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda.
Si se trata de ARN, la técnica se llama NORTHERN BLOT. Se utilizan sondas ADN marcadas
Si se trata de proteínas, la técnica se llama WESTERN BLOT. Las proteínas se separan electroforeticamente en un gel de poliacrilamida
Conceptos Básicos
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO
El híbrido sonda/secuencia diana se forma en solución normalmente en pocillos de una placa microtiter y posteriormente se fija a la pared del pocillo para proceder a su detección.
Una característica de estas técnicas es que habitualmente no se marca ni la sonda ni la muestra y el híbrido se detecta por métodos indirectos más o menos completos.
Estas técnicas se han desarrollado fundamentalmente para
-Diagnóstico microbiológico.
-Detección de virus.
Permiten analizar múltiples muestras simultáneamente y son fácilmente automatizables.
Las más importantes son
-La técnica de captura de híbrido
-La técnica de ADN ramificado
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN IN SITU
Permiten detectar y localizar secuencias de ácidos nucleicos sobre:
-Cromosomas metafásicos
-Células
-Tejidos
La hibridación de los ácidos nucleicos se realiza directamente sobre:
-Extensiones citológicas
-Secciones de tejido
Dependiendo del marcador se diferencian 2 tipos de ISH. Ambas se han automatizado.
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN IN SITU
Hibridación in situ fluorescente (FISH)
Las sondas se marcan con fluorocromos.
Hibridación in situ fluorescente (FISH)
Hibridación in situ cromogénica (CISH)
Las sondas se marcan con haptenos los híbridos se detectan por métodos inmunohistoquímicos.
Hibridación in situ cromogénica (CISH)
2. DOT BLOT
punto 2
Es una técnica de hibridación que utiliza membranas de nitrocelulosa o nylon como soporte sólido, permite detectar secuencias de ácidos nucleicos en una mezcla compleja.
Es la forma más simple de hibridación.
Sobre las membranas se coloca directamente una gota de la muestra que se va a analizar, que puede ser:
-Un ácido nucleico purificado.
-Un lisado celular.
-Un producto de amplificación por PCR.
Esta técnica permite el estudio simultáneo de varias muestras, aplicando cada muestra en una zona distinta de la membrana y se puede realizar con
-Sondas radiactivas
-Sondas marcadas con haptenos.
Si las aplicaciones se realizan en forma de banda en lugar de en forma circular la técnica se denomina slot blot. La técnica se lleva a cabo incubando secuencialmente las membranas con los reactivos por inmersión en:
-Cubetas.
-Bolsas de plástico termosellables o con cierre hermético.
-Frascos con tapón de rosca.
https://youtu.be/EzEeWMOZr3c
PROTOCOLO DE DOT BLOT
Hay múltiples protocolos de hibridación, según el tipo de muestra, las sondas, el marcaje, la rigurosidad requerida, etc.
Protocolo de dot blot
• Primero se comienza con la aplicación de la muestra a la membrana y se continúa con 4 fases prehibridación
• hibridación
• lavado de poshibridación
• detección del híbrido
Aplicación de la muestra al soporte
Antes de iniciar la aplicación de las muestras hay que:
Aplicación de la muestra al soporte
1) Humedecer la membrana
2) Se saca del líquido humectante y se retira el exceso de este
3) se ensambla en un sistema de vacío que permite una adecuada fijación de la muestra a la membran
El proceso de aplicación de la muestra varía ADN y ARN
4) Normalmente la hibridación se lleva a cabo en bolsas, que requieren un volumen pequeño de reactivos para minimizar el consumo de sonda.
UNIDAD DE DOT BLOT, CABEZAL DE MICROFILTRACION
Aplicación de muestras de ADN
1) Las muestras de ADN deben ser desnaturalizadas
2) Después se neutralizan con acetato de amonio
3) Una vez neutralizadas, se cargan en las posiciones correspondientes de la plantilla y se aplica vacío.
4) Cada muestra puede ser lavada
5) Luego se desmonta el sistema de vacío
6) Se lava la membrana.
7) Se seca en estufa
8) Se realiza la unión del ADN a la membrana, por lo que las bases nitrogenadas quedan libres para poder hibridar con la sonda.
Aplicación de muestras de ARN
Para evitar la formación de horquillas intracatenarias que dificultan la hibridación, se desnaturaliza también las muestras de ARN, el tratamiento es más suave:
Prehibridación
1) Se utiliza NaOH 10 mM y EDTA 1 mM.
2) El lavado se realiza con la misma solución.
3) Una vez extraída la membrana del sistema de vacío
La nitrocelulosa se seca a 80ºC
El nailon se seca en la estufa o se irradian con UV.
Prehibridación
Se bloquean las posibles uniones inespecíficas de la sonda .
Las soluciones de prehibridación suelen tener la misma composición que las soluciones de hibridación, pero sin sonda.
Pueden llevar un ADN carrier.
La membrana se incuba con esta solución a la misma tª a Ia que se realizará posteriormente la hibridación.
Tiempo de incubación varía mucho.
HIBRIDACION
1. Las sondas de ADN bicatenario se desnaturalizan inmediatamente antes de su uso
Calentando entre 95º - 100ºC durante 5’ y enfriando rápidamente en hielo
2. En el paso siguiente, se retira la solución de prehibridación y se sustituye por un volumen igual de solución fresca. Ahi se añade la sonda recién desnaturalizada
3. Por ultimo se incuba la membrana con esta solución a una temperatura adecuada y en agitación durante 4-24hs
Hibridación
Lavado de post hibridación
1. Si las fases anteriores fueron realizadas en bolsa, se procede a secar la misma y se coloca en una cubeta para hacer el lavado en agitación
2. Es necesario, hacer de 2 a 3 lavados con soluciones que aumenten progresivamente las condiciones de rigurosidad
Por ej: Disminuyendo la fuerza ionica de la solución o elevando la temperatura del lavado
Lavado de posthibridación
Detección del híbrido
Dependera del tipo de marcaje que lleve la sonda. Puede ser:
A. Marcaje radiactivo: Finalizado el ultimo lavado de posthibridacion, la membrana se puede secar y se revela por la exposición autorradiografica (se coloca una placa radiográfica encima y manteniendo el conjunto en la oscuridad de horas a días . Revelada la placa aparecerán puntos negros correspondientes a las muestras positivas (las que tenían secuencia diana)
Si la membrana con las muestras se va a reutilizar para una segunda hibridación, no se debe secar se envuelve plástico para mantenerla humeda y evitar el contacto con la placa fotográfica.
B. Marcaje con haptenos: Luego de los lavados, revela con un método de detección cromogenico
El resultado final es una mancha coloreada en las posiciones a las muestras positivas.
A diferencia del marcaje radiactivo en esta técnica no se puede reutilizar para una segunda hibridación ya que los compuestos coloreados que se generan son insolubles, precipitan y tiñen la membrana de manera indeleble
Detección del híbrido
REHIBRIDACION
Cuando se usan sondas radiactivas, las membranas
pueden someterse a nuevas rehibridaciones con
otras sondas, para lo que hay que desnaturalizar los híbridos formados y eliminar la 1ª sonda utilizada.
Es fundamental que la membrana permanezca siempre
húmeda y no se seque durante la autorradiografía.
Para despegar la 1ª sonda, la membrana se somete a 2
lavados de 20 min cada uno
con una solución de baja fuerza iónica, con
detergente
Rehibridación
¿CÓMO SE COMPRUEBA SI EL LAVADO HA SIDO EFECTIVO?
1. Se expone una nueva placa radiográfica toda la noche.
2. Se revela y se comprueba que la placa está limpia.
A continuación se inicia nuevamente el protocolo de
hibridación a partir de la prehibridación.
Aplicaciones del DOT BLOT
Se distinguen:
1. Como técnica de rastreo
2. Aplicaciones específicas
- ASO dot blot
- Dot blot inverso
- Hibridación de colonias
- Hibridación de placas virales
El dot blot se puede utilizar como técnica de screening para detectar secuencias de interés en múltiples muestras simultáneamente.
Dot blot como técnica de rastreo
Algunos ejemplos de este tipo de aplicación son:
1. Estudios de expresión génica.
2. Detención de secuencias extrañas en
muestras biológicas.
3. Control de calidad de PCR.
4. Control de calidad del marcaje de sondas.
ANOTACIÓN
En la técnica del ejemplo 3 podemos calcular la SENSIBILIDAD y el LIMITE DE DETENCIÓN.
SENSIBILIDAD:
Qué es
es el cambio mínimo en la concentración que puede detectarse de forma significativa
LIMITE DE DETENCIÓN:
es la mínima concentración que podemos determinar
ASO dot blot
Se emplea para buscar mutaciones mediante empleo de oligonucleótidos especificos de alelo (ASO)
Requiere una PCR previa, cuyo producto será utilizado como muestra para luego hibridar con ASO
ASO dot blot
Los individuos que dieran positivo para las dos hibridaciones serían heterocigotos (poseen un alelo normal y uno mutado), mientras que aquellos que solamente presentasen hibridación en uno de los casos serían homocigotos para ese caso (alelo normal o mutado).
Ejemplo
En este ejemplo el individuo 1 sería heterocigoto para dicho gen (alelos normal y mutante), el individuo 2 sería homocigoto para el alelo normal o wild type , el 3 homocigoto para el mutante, y así sucesivamente con los restantes
Aplicaciones específicas: dot blot inverso
Dot blot inverso
Igual que el ASO BLOT pero primero se coloca la sonda con las secuencias específicas y luego se añade la muestra. Usada en talasemias.
En la membrana se inmovilizan los oligonucleótidos específicos de alelo sin marcar, permite estudiar genes con un gran número de variantes alélicas que afectan a distintas zonas del gen.
Se marca el producto de PCR, utilizando nucleótidos marcados en la PCR o usando cebadores marcados.
Se emplea una membrana que se hibrida con el producto de PCR marcado
Procedimiento
El paciente del ejemplo presenta:
- Heterocigoto para el alelo 1( normal y mutante)
- Homocigoto para el alelo 2 en su variante normal (o bien presenta una deleción en uno de los cromosomas de dicha región de ADN),
- Homocigoto para el alelo 3 en su variante mutada,
- Homicigoto para la versión normal de los alelos 4 y 5, etc.
Aplicaciones específicas, hibridación de colonias
Se utiliza para detectar bacterias que contienen una secuencia génica concreta.
Hibridación de colonias
•A partir de una placa de cultivo, con colonias bacterianas aisladas, se recorta una membrana para el Dot Blot.
•Se lisan las bacterias y se desnaturaliza el ADN, colocando la membrana sobre un papel para que se seque.
•Se aplica calor y se realiza un Dot Blot tradicional.
•Tras el relevado: mancha oscura donde la membrana contactó con una colonia que portaba la secuencia diana.
Hibridación de placas virales
También llamado Plaque Lift. Detectan virus que portan la secuencia diana.
Es especialmente relevante en tecnologia de ADN recombinante para localizar los fagos con la secuencia clonada