E.G. - JC - Apis Mellifera

PCR-RFLP de DNA mitocondrial revela duas origens de Apis mellifera em Taiwan

https://www.journals.elsevier.com/saudi-journal-of-biological-sciences/

O polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) é uma técnica inventada em 1984 pelo cientista inglês Alec Jeffreys durante a pesquisa em doenças hereditárias. É usado para a análise de testes padrões originais no DNA fragmentado a fim diferenciar-se geneticamente entre organismos.

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Black Mirrow - 3X06

PCR-RFLP em mtDNA

TEMA E ASSUNTO

Origem das espécies utilizando o material genético.

Conhecer as origens matrilineares da A. mellifera em Taiwan

OBJETIVO

Diz-se do sistema de filiação e de organização social no qual só a ascendência materna é levada em conta para a transmissão do nome, dos privilégios, da condição de pertencer a um clã ou a uma classe. - [ Aurélio ]

JUSTIFICATIVA

O de identificação de subespécies de A. mellifera e o estudo de sua distribuição na ilha para facilitar programas de melhoramento cientifico e estabelecer um setor de apicultura mais desenvolvido.

Tem sido geralmente assumido que A. mellifera em Taiwan é composto de híbridos de diferentes subespécies. No entanto, nenhum estudo havia sido realizado até então para confirmar tal afirmação, com isso, a identificação de subespécies de abelhas via caracterização molecular será utilizada para conferir tal afirmação.

HIPÓTESE

A indústria da apicultura em Taiwan deve sua popularidade e importância econômica ao clima tropical / subtropical, que fornece uma oferta abundante de plantas ricas e diversificadas de néctar.

Além de ajudar na polinização das culturas, as 120.000 colônias manejadas de Apis mellifera nesta ilha produziram em 2015 cerca de 12.000 toneladas de mel varietal, bem como 430 toneladas de geleia real (ocupando o segundo lugar no mundo).

INTRODUÇÃO

Registros oficiais mostraram que subespécies de A. mellifera, incluindo armeniaca, capensis, carnica, caucasica, cipria, ligustica e mellifera foram importadas para melhorar o rendimento de vários produtos apícolas durante o período de 1911 a 1997.

Em Taiwan, essas abelhas ocidentais de alguns apiários são conhecidas por produzirem alto rendimento de geléia real, enquanto as abelhas de outros quintais são melhores produtoras de mel.

. PCR mtDNA

. Amostragem

. Extração de DNA total

MATERIAIS E MÉTODOS

. Enzima de restrição

. Eletroforese

. Sequenciamento

Amostragem

MATERIAIS E MÉTODOS

Extração de DNA total

MATERIAIS E MÉTODOS

Utilizado o Kit Easy DNA (Saturn Biotech, Austrália)

Perna dianteira foi removida;

Secou-se durante 5 min a 50ºC;

Homegeneizou-se com as soluções 1A, 1B e solução 2;

Incubou durante 30 min a 95ºC;

Amostras foram centrifugadas;

Sobrenadantes com DNA foram sujeitos a análise de mtDNA

PCR mtDNA

Foram selecionadas por PCR os fragmentos da região tRNALeu-COII intergénica, Cit b, Ls rRNA e COI de mitocôndrias.

MATERIAIS E MÉTODOS

PRIMES

PCR mtDNA

MATERIAIS E MÉTODOS

PCR foram realizadas utilizando o perfil térmico:

98 ° C durante 30 s,

35 ciclos de 98 ° C durante 10 s,

40/45/50 ° C durante 15 s,

72 ° C durante 50 s e terminou com

72 ° C durante 5 min.

Cada produto de amplificação por PCR foi digerido com o enzima de restrição (Tabela 2) num volume final de 20 uL, contendo 10 x tampão de reação, 17 uL de DNA e 1 uL de enzima restrição (NEB, EUA), com incubação durante a noite a 37ºC,

ENZIMA DE RESTRIÇÃO

Eletroforese

Os tamanhos dos fragmentos de PCR e amplificação de enzimas de restrição de produtos da digestão foram analisados pelo sistema avançado QIAxcel (Qiagen, EUA). Os fragmentos de DNA foram separados em gel de car- QIAxcel Tridge usando QIAxcel Método AM420 e os dados de sinal de imagem recolhidos foram convertidos em gel pelo ScreenGel Software QIAxcel. O marcador de tamanho e de marcador de alinhamento utilizado no presente sistema é de 100 pb / 2,5 kp e 15 pb / 5 kb, respectivamente.

MATERIAIS E MÉTODOS

Sequenciamento

Os fragmentos amplificados do gene de tRNALeu-COII foram clonados em pGEM-T (Promega, EUA) e sequenciados a partir de ambas as direcções. As sequências resultantes foram comparadas com sequências publicadas disponíveis no Genbank. alinhamento de sequências de DNA foi realizada, utilizando o algoritmo Clustal W de software Vector NTI® V10 (Invitrogen, EUA). Na análise filogenética, as sequencias de nucleidos foram alinhadas para construir uma árvore filogenética utilizando o método de neighbor-joining no programa MEGA6 com um modelo Tamura 3-Parâmetro, deleção de pares de lacunas, e 1000 repetições de bootstrap.

MATERIAIS E MÉTODOS

O Vector pGEM-T é preparado cortando o Vector pGEM-5Zf (+) da Promega com EcoRV e adicionando uma timidina 3' terminal a ambas as extremidades. Estas saliências 3 '-T únicas no local de inserção melhoram grandemente a eficiência da ligação de um produto de PCR no plasmídeo.

A amplificação por PCR de fragmentos de DNA mitocondrial de

A. mellifera

Todos os quatro fragmentos de mtDNA, (a região intergénica tRNALeu-COII, Cit b, Ls rRNA, e COI) foram amplificados com sucesso para todas as amostras.

Foram observados dois tamanhos de amplicação para a região do tRNALeu-COII de 580 (245 amostras ) e 930 pb (35 amostras).

RESULTADOS

E DISCUSSÃO

Este resultado é semelhante ao de um estudo de abelhas Tailândia ocidentais que produziu duas amplificações com tamanhos de 573 e 837 pb de fragmentos tRNALeu-COII

Os tamanhos das amplificações Cit b, Ls rRNA e COI são de 500, 800, e 1100 pb, respectivamente, que correspondentes com estudos anteriores.

PCR

RFLP de quatro regiões de mtDNA em 280 amostras de

A. mellifera

RESULTADOS

E DISCUSSÃO

ANÁLISE

FILOGENÉTICA

CONCLUSÃO

Artigo Complementar - 1

Um método simples de PCR-RFLP para genotipagem do polimorfismo de IFNL4 rs368234815 em pacientes com com Hepatite C crónica

O polimorfismo IFNL4 rs368234815 desempenha um papel importante na eliminação espontânea e induzida pelo tratamento da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV)

Em todo o mundo, aproximadamente 150 milhões de pessoas estão infectadas com o vírus da hepatite C (HCV), e cerca de 500.000 pessoas morrem anualmente de doenças crônicas relacionadas à infecção pelo HCV, como cirrose e carcinoma hepatocelular.

INTRODUÇÃO

Fonte: Supermax-Brasil (2018)

Nos últimos anos, o tratamento de HCV foi associado à terapia de combinada, consistindo em interferon peguilado (PEG-IFN) e ribavirina (RBV).

Recentemente, estudos mostraram que a resposta à terapia combinada com PEG-IFN / RBV foi afetada por fatores genéticos do hospedeiro e do vírus. Entre os fatores genéticos do hospedeiro, o polimorfismo rs368234815e no exon-1 do interferon lambda 4 (IFNL4).

Os resultados de estudos anteriores determinou genotipagem do IFNL4 rs368234815 utilizando métodos que necessitam de instrumentos e materiais caros.

INTRODUÇÃO

Desenvolvimento de um método simples, barato e rápido para genotipagem do polimorfismo IFNL4 polimorfismo rs368234815 pode ser útil.

OBJETIVO

Desenvolver uma reação do polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (PCR-RFLP) em cadeia simples, barata e rápida, para genotipagem do polimorsfismo IFNL4 rs368234815.

• Genotipagem do IFNL4 por PCR e sequenciamento

• Estudo da População

• Extração de DNA

MATERIAIS E MÉTODOS

• Protocolo de validação

• Genotipagem do IFNL4 através da PCR-RFLP

Estudo da População

MATERIAIS E MÉTODOS

• Foram 87 pacientes com infecção crônica de HCV
• 70 homens e 17 mulheres
• Idade média entre 30 a 40 anos (30 anos e 6 meses e 39 anos e 8 meses)
• Critérios para a cronicidade da infecção pelo HCV : Resultado positivos para anticorpos contra o HCV e RNA de HCV por um período de mais de 6 meses.

Extração de DNA

• Utilizado o QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN)

• Extraído de 200 ul de fluido da camada leucoplaquetária

MATERIAIS E MÉTODOS

Genotipagem do IFNL4 por PCR e sequenciamento

• Reaçõs de PCR utilizando Accupower PCR PreMix (Bioneer Corporation)

• Amplificou de 100 ng a 300 ng de DNA genómico utilizando 10pmol do primer rs12-F e rs12-R. (Tabela 1)

• Temperatura 94 C a 5 min, 35 ciclos de 94 C a 20 seg, 66 C a 20 seg e 72 C a 20 seg, seguido por 72 C a 5 min.

• Sequenciados utilizando BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kits e analisados usando Chromas Lite Version 2.1.1

Tabela 1 - O nucleótideo sublinhado representa incompatibilidade, para suprir o local de restrição não específico perto do polimorfismo rs368234815.

• Os produtos de PCR-RFLP clivados foram separados em gel de agarose a 3% ao lado do GeneRuler DNA Ladders de 100 pb. (Figura 3)

• O perfil da temperatura PCR-RFLP foi diferente

• Para a análise do RFLP, o produto da PCR do rs368234815 foi clivado por 10 unidades da endonuclease de restrição MspA1I.

TABELA 1

Região Genómica do IFNL4 e Primer modelo da PCR-RFLP

RESULTADOS

• O gene IFNL4 situa-se na região genómica 24 Kb entre (IFNL2) e (IFNL3). Esta região do cromossoma 19 contém poucas sequências homólogas e os desenhos de primers podem ser afetados por este problema. Para conceber o método de PCR-RFLP, avaliou-se uma região de 20 nucleótidos que contenha IFNL4 polimorfismo rs368234815 no meio da sequência, utilizando software Gene Runner foi descoberto o rs368234815.

• Foi selecionado uma região de 1000 pb (39248015 a 39249014 ) da montagem primária que contém o polimorfismo rs368234815 no meio da seqüência e avaliou com o BLAST.

• Considerando a alta homologia nesta região genômica foi realizado um alinhamento usando MegaBLAST (sequências altamente similares) e encontrou 88% semelhança entre a região de 1000 pb selecionada e as região genômica localizada em 39263982 a 39264945.

Região Genómica do IFNL4 e Primer modelo da PCR-RFLP

RESULTADOS

Figura 1 - Cromossomo 19, gene IFNL4, polimorfismo rs368234815 e os primers para reação em cadeia da polimerase - polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (PCR-RFLP).

Região Genómica do IFNL4 e Primer modelo da PCR-RFLP

RESULTADOS

Figura 3 - Resultado em eletroforese do (PCR-RFLP) do polimorfismo IFNL4 rs368234815. A banda 4 tem 100 pb. As bandas 5 e 6 não eram parte do grupo controle de modelo e de PCR não clivados, respectivamente. Para eletroforese de produtos de reação em cadeia da polimerase digerida (PCR), gel de agarose a 3% foi usado.

• Em geral, estes métodos têm certas limitações, incluindo a dependência de instrumentos com tecnologia sofisticada e possível falta de acessibilidade por parte de alguns laboratórios.

• Embora o presente método de PCR-RFLP não é aceitável como um método de alto rendimento, que pode servir como um método de alta velocidade para a genotipagem de um pequeno número de amostras.

• O presente estudo é dependente de síntese de primers e a síntese dos mesmos podem ser realizada mesmo por fornecedores locais.

• Em conclusão, o método PCR-RFLP que foi desenvolvido para a genotipagem de rs368234815 é preciso, barato, rápido e fácil de realizar.

• Este método é comparável ao método de sequenciamento por PCR, que é o método padrão de critério para a detecção de marcadores genéticos, e, portanto, pode ser usado para o trabalho clínico e de pesquisa

CONCLUSÃO

Artigo Complementar - 2

Identificação de espécies de carne por reação em cadeia da polimerase no polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (PCR-RFLP) do gene 12S rRNA mitocondrial

INTRODUÇÃO

A adulteração de carnes e produtos de alta qualidade com os seus homólogos inferiores (mais baratos) é um problema na indústria da carne.

Os principais danos causados por esses alimentos estão ligados ao aparelho digestivo.

Os sintomas imediatos são diarreia, fortes dores abdominais e vômito, mas isso depende de cada organismo.

Essas carnes acabam contendo micro-organismos (bactérias, fungos e protozoários) e, dependendo de como atingir a pessoa, vão causar um tipo de sintoma. Crianças e idosos têm uma facilidade muito grande de desidratação e podem acabar morrendo.

ADENDO

Operação Carne Fraca é uma operação deflagrada pela Polícia Federal do Brasil, e teve início no dia 17 de março de 2017.

Frigoríficos investigados na Operação Carne Fraca usavam produtos químicos para "maquiar" carne vencida, injetavam água para aumentar o peso dos produtos e, em alguns casos, foi constatada ainda falta de proteína na carne.

Eles usavam ácidos e outros produtos químicos para poder maquiar o aspecto físico do alimento. Usam determinados produtos cancerígenos em alguns casos para poder maquiar as características físicas do produto estragado, o cheiro.

No caso da falta de proteína, o delegado explicou que havia substituição. "Foi trocada por fécula de mandioca ou proteína da soja, que é muito mais barata, mais fácil de substituir."

http://g1.globo.com/pr/parana/noticia/2017/03/policia-federal-detalha-operacao-que-investiga-venda-de-carnes-vencidas.html

INTRODUÇÃO

Na PCR-RFLP, uma região conservada da sequência de DNA é amplificada utilizando PCR, seguido de digestão com enzimas de restrição, o que pode revelar variação genética entre espécies.

Ambos os genes nucleares e mitocondriais foram alvo de detecção de espécies por PCR-RFLP. Entre os genes mitocondriais, o gene citocromo b, D-ciclo, O gene de rRNA 12S e o gene de rRNA 16S têm sido utilizados para identificação de espécies.

Neste estudo, utilizou a PCR_RFLP do gene 12S rRNA mitrocondrial como método para identificação de espécies de carne fresca/processada para carne bovina, de búfalo, de carneiro e de cabra.

Búfalo

Carneiro

Ovelha

Vaca

Boi

Cabra

Bode

ANIMAIS

Materiais

Proteinase K, ribonuclease A, Taq e dNPTPs - Sigma ou Merck

Marcadores de DNA - Bangalore Genei (Bangalore, India)

Primers - Operon Inc.

Enzimas de restrição AluI, BspTI e ApoI - MBI Fermentas (Canadá)

Enzima de restrição HhaI - Bangalore Genei, (Bangalore, Índia)

MATERIAIS E MÉTODOS

Isolamento de DNA da amostra

MATERIAIS E MÉTODOS

O isolamento de DNA de amostras de carne foi realizado como descrito por Chikuni et al. (1994).

Resumidamente, as amostras de carne foram trituradas e misturadas com tampão de lise contendo 0,1 mg / ml de Proteinase K durante 3 h a 50°C.

A mistura resultante foi tratada com 50 µg / ml de RNase A durante 1 h a 37ºC,

O DNA precipitado por etanol e solução de acetato de amónio 1 M foi dissolvido em tampão TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,4 e EDTA 0,1 mM).

A concentração de DNA foi determinada medindo a absorvância a 260 nm.

PCR

Iniciadores universais para o gene 12S rRNA mitocondrial

Forward-5'-CAA ACT GGG ATT AGA TAC CCC ACT AT-3',

Reverse-5'-GAG GGT GAC GGG CGG TGT GT-3'

Termociclador Cycler (Eppendorf, Alemanha):

5 min a 94 ° C para desnaturação inicial;

seguido por 30 ciclos de amplificação

(45 s a 94 C, 45 s a 60 ° C e 1 min a 72 C)

e extensão final durante 10 min a 72 C.

Produtos A PCR foram analisados por electroforese em 1% de gel de agarose com brometo de etídio.

MATERIAIS E MÉTODOS

A análise da sequencia e restrição

MATERIAIS E MÉTODOS

Os produtos de amplificação de gene mt 12S rRNA foram sequenciados utilizando ABI Prism 377, sequenciador de DNA automatizado na Universidade de Deli, (Nova Deli, Índia.)

As sequências foram analisadas utilizando o programa Editseq e mapas de restrição utilizando o programa MapDraw de software Lasergene (DNAstar, Inc., Nova Iorque).

As enzimas de restrição com padrões de restrição únicos no que diz respeito a cada uma das espécies foram selecionados usando tabulação e comparação.

As sequências foram submetidas à base de dados europeia laboratório de biologia molecular (EMBL) e foram designados com os números de acesso, viz., AJ490501 (gado), AJ490502 (Búfalo), AJ490503 (carneiros) e AJ490504 (cabra).

RFLP

MATERIAIS E MÉTODOS

As amplificões da PCR do gene 12S rRNA mitocondrial foram sujeitos a digestão com enzimas de restrição adequadas de acordo com as instruções dos fornecedores.

Resumidamente, preparou-se mistura de enzima-tampão misturando 2 ul de enzima de restrição com 8 ul do respectivo tampão.

Preparou-se a mistura reacional misturando 10 ul de produto de PCR com 2 ul de mistura de tampão de enzima.

Volume foi feito até 20 ul com água autoclavada e incubado durante a noite a 37 ° C.

O produto digerido foi visualizado por electroforese em gel de agarose a 2% em conjunto com uma escada de 100 pb (Bangalore Genei).

Iniciadores universais utilizados neste estudo amplificaram um fragmento de 456 pb do gene 12S rRNA mitocondrial em todas as quatro espécies, ou seja, gado bovino, búfalo, ovino e caprino.

Pelo menos 10 amostras de cada espécie foram submetidas a amplificação por PCR e utilizadas para estudos subsequentes de RFLP.

A amplificação uniforme foi observada em carnes processadas a 72, 90, 120ºC por 30 min e carnes submetidas à fritura profunda.

No entanto, a intensidade do sinal diminuiu com o aumento da temperatura de cozimento e foi menor nas amostras de carne submetidas a 120 ° C por 30 min.

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS

CONCLUSÃO

1 - Tortas (72ºC) * 2 - Blocos cozidos a vapor (90ºC) * 3 - Fritura profunda em gordura

4 - Blocos autoclavados (120ºC por 30 min)