Copia de Evaluación de protocolos de extracción de ADN en tortugas marinas

Análisis y discusión de resultados

Área de estudio

Metodología

Objetivos

Tabla 1: Descripción de las estaciones monitoreadas en la Península de Santa Elena entre mayo y junio de 2023.

Análisis comparativo de tres protocolos de extracción de ADN en carne de tortugas marinas varadas en playas de la Península de Santa Elena entre mayo y junio de 2023.

Frecuencia de varamientos.

• 18 especímenes durante los meses de mayo y junio.
• E2 (N=6), E9 (N=5), E5 (N=0).

Identificación y descripción de los especímenes

Caracterización de los especímenes.

• Geolocalización. Handy GPS v.40.4.
• Identificación in situ del individuo: especie, sexo, edad.
• Claves de identificación: biometría del caparazón (LC, AC, LR, AR) y cabeza, escamas prefrontales, escudos del caparazón, número de dedos, entre otros.
• Valoración del estado de descomposición y causas de muerte.

TRABAJO DE UNIDAD DE INTEGRACIÓN CURRICULAR II

Figura 9: Registros de especies de tortugas marinas varadas en las playas de Santa Elena

Tabla 3: Claves de identificación de tortugas marinas en Ecuador.

Objetivo general:

• Comparar tres protocolos de extracción de ADN en carne de tortugas marinas mediante el análisis y cuantificación del ácido nucleico para la obtención de un método sencillo, económico, reproducible y no contaminante.

Objetivos específicos:

• Aplicar tres protocolos de extracción de ADN mediante el uso de enzimas, solventes orgánicos, agentes quelantes o sales, así como métodos mixtos, para determinar su efectividad en el análisis de ácidos nucleicos.

• Analizar la calidad y cantidad de ADN según la procedencia de la muestra valorando sus estados de descomposición y el tipo de tejido.

• Evaluar dos métodos de preservación de muestras mediante el análisis de la pureza, calidad y cantidad de ácidos nucleicos para el desarrollo de una técnica estandarizada con carne de tortuga marina.

Figura 3: Representación gráfica.

Figura 10: Registros del sexo de tortugas marinas varadas en las playas de Santa Elena

Figura 2: Identificación de especímen y toma de muestra.

Tabla 4: Criterios para valorar estados de descomposición.

Figura 11: Registros de las causas de muerte de tortugas marinas varadas en las playas de Santa Elena

Expositor:

Francesco Saltos Coello

Docente proponente:

Blga. Janeth Galarza. PhD.

LA LIBERTAD-ECUADOR

2023

Figura 12: Estado de descomposición registrados en tortugas marinas varadas en las playas de Santa Elena

Figura 8: Cantidad de varamientos por Estaciones. En rayas, se muestra lo registrado por (Suárez, 2015)en la misma estación.

• H1: La media de los valores de concentración y pureza del ADN será diferente entre los tres protocolos de extracción evaluados

Hipótesis

Figura 1: Mapa de la provincia de Santa Elena con las playas monitoreadas para el registro de varamientos de tortugas marinas.

Elaboración propia. QGIS.

• (Work, 2000). Manual de Necropsia de Tortugas Marinas para Biólogos en Refugios o Áreas Remotas.
• (Wyneken, 2004). La Anatomía de las Tortugas Marinas.
• (Reséndiz, 2017). Análisis de los cambios post mortem de tortugas marinas del Pacífico de Baja California Sur, con técnicas forenses.

• (Suárez, 2015). Evaluación de los varamientos de tortugas marinas en las playas de la parroquia Manglaralto,
• (Solórzano, 2015). Conservación de tortugas marinas; reducción de las amenazas al habitad de anidación dentro del Refugio de Vida Silvestre y Marino Costera Pacoche y su zona de influencia.
• (Tutiven, 2020). Evaluación de casos de varamientos de tortugas marinas en el Centro de Rehabilitación de Fauna Marina del Parque Nacional Machalilla, Ecuador, 2014-2019.
• (Menéndez, 2015). Identificación de las causas de muerte y varamientos de tortugas marinas (Chelonioidea) en la playa de La Diablica-Salinas, entre los meses de octubre de 2014 a marzo de 2015.

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Curva típica de ADN

Análisis y discusión de resultados

Metodología

Curvas de ADN.

• La evaluación cualitativa permitió la selección de las mejores muestras para análisis.

Introducción

Protocolos de extracción de ADN.

• Protocolo de extracción de sal común NaCl. 0% modificado.
• Protocolo de extracción de gradiente de sales. 55% modificado.
• Protocolo de extracción de gradiente de sacarosa. 61% modificado.

Cuantificación de ADN por espectrofotometría.

• Nanodrop 2000.
• 72 muestras, 2 réplicas/muestra=144 réplicas/protocolo.

Tabla 6: Recopilación de las mejores réplicas analizadas de los 18 especímenes colectados.

Colección de muestras.

• Determinación del lugar de corte o tipo de tejido conveniente.

Preservación de muestras y congelación.

Laboratorio de Biología Molecular de UPSE.

50mg/muestra|6 muestras/preservante.

• Congeladas.
• ARNLater.
• Etanol 40%.
• Etanol 96%.

Total de 432 muestras preservadas.

Codificación con formato: LL-DDMM-N. Ej. AC04052

Figura 7: Producto o pellet de ADN extraído.

Contaminada por sales

Tabla 5: Resumen de las cantidades y concentraciones de los protocolos utilizados.

Figura 4: Zonas de corte y extracción de muestra en bícep.

Ron, 2018

Análisis estadístico.

• Análisis Probit.
• Análisis de Varianza (ANOVA) de un sólo factor.

• (Aljanabi, 1997). Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques.
• (Rodríguez, 2017). Análisis comparativo de tres protocolos de extracción de ADN en cangrejo azul Cardisoma crassum.
• (Escalante, 2020). Efecto de la temperatura en la amplificación del Gen 18S ARNr de dos microalgas a través de la reacción en cadena de la polimerasa PCR.
• (Lahiri y otros, 1991). A rapid non-enzymatic method for the preparation of HMW DNA from blood for RFLP studies.
• (Daly y otros). CYP2D6 multiallelism.

Figura 5: Total de muestras preservadas.

Figura 6: Procesamiento de muestras colectadas.

Contaminada por proteínas

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• Las tortugas marinas cumplen con roles importantes para el mantenimiento de las funciones ecológicas, estructura y dinámica de los ecosistemas marinos.
• Sus especies se distribuyen en aguas tropicales y subtropicales de todo el mundo.
• Sus poblaciones han sido drásticamente reducidas debido, en gran parte, a las interacciones con los seres humanos.
• Captura directa e incidental por pesquerías comerciales.
• Degeneración de su hábitat.
• Falta de evidencia científica sobre el impacto antropogénico en la conservación de estas especies en Ecuador.
• La genética forense puede contribuir a la conservación de las tortugas marinas.
• Identificación de especies comercializadas ilegalmente.
• Identificación de sitios natales de adultos reproductores.
• Conectividad genética entre las colonias y zonas de forrajeo.
• Análisis filogeográficos y de estructuras poblaciones.
• Para estudios genéticos se requiere ADN de alta calidad.
• Existen limitantes para la identificación externa de las especies varadas.
• Los métodos de extracción varían según la especie, el tipo de muestra y el estado de descomposición.
• Es importante estandarizar métodos de extracción de ADN en carne de tortuga marina.

Contaminada por sales y proteínas

Figura 13: Recopilación de las mejores réplicas analizadas de los 18 especímenes colectados.

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Análisis y discusión de resultados

Conclusiones y recomendaciones

Análisis y discusión de resultados

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(Taboada, y otros, 2017)

Tipo de tejido:

• Concentración de ADN: Ligamento con 94.04 ± 89.9 ng/µL (p=0.497, ANOVA ).
• Pureza (260/280): Músculo con 1.598 ± 0.25 (p=0.908, ANOVA )
• Normalmente se usa tejido muscular pero también se han usado tejidos óseos, cáscaras de huevo, tejidos de caparazón de neonatos, cordón umbilical, etc.

(Taboada, y otros, 2017)

Contaminación de las muestras

• De las 437 muestras, 104 resultaron contaminadas. De estas 333, se seleccionaron 229 muestras con curvas fidedignas.

(Proaño-Bolaños, y otros, 2016)

Estado de descomposición:

• La relación fue inversamente proporcional para ambos casos.
• Concentración de ADN: Estado fresco con 145.1 ± 87.4 ng/µL (p=0.000, ANOVA ).
• Pureza (260/280): Estado fresco con 1.77 ± 0.25 (p=0.000, ANOVA ).

Se ha estudiado la descomposición de tejidos óseos de L. kempii en ambientes controlados.

• Algunas de sus muestras más descompuestas pudieron ser secuenciados luego de 1,152 días.
• Concentración promedio de 14.66 ng/µL, con mínimos de 1.58 hasta 46.27.
• El valor promedio del presente fue de 88.91 ± 76.41 ng/µL.

Objetivo: "Comparar tres protocolos de extracción de ADN en carne de tortuga marina mediante el análisis y cuantificación del ácido nucleico para la obtención de un método sencillo, económico, reproducible y no contaminante".

• Se determinó que el protocolo de Gradiente de Sales (con lisis química) cumplió con los criterios evaluados.
• Tuvo un 26.78% (Probit, 95% de confianza) en contaminación.
• La concentración promedio de ADN más alta de 120 ± 73.85 ng/µL (ANOVA, p=0.000)
• Pureza 260:280 aceptable de 1.60±0.23 (ANOVA, p=0.043).
• Fue 87.15% más económico y 33.33% menos contamiante que el protocolo de NaCl.

Objetivo: "evaluar la calidad y cantidad de ADN según la procedencia de la muestra valorando sus estados de descomposición y el tipo de tejido".

• La relación entre los estados de descomposición y la concentración y pureza de ADN fue inversamente proporcional con un valor p=0.000.
• Primer estudio que reporta la extracción de ADN en tortugas marinas varadas y descompuestas.
• Los datos para concluir acerca de los tejidos fueron estadísticamente poco significativos con p=0.497 en los valores de concentración y p=0.908 en pureza.
• Las muestras de ligamentos mostraban curvas fidedignas en estado de descomposición 4.

Objetivo: "Evaluar dos métodos de preservación de muestras mediante el análisis de la pureza, calidad y cantidad de ácidos nucleicos para el desarrollo de una técnica estandarizada con carne de tortuga marina".

• Las muestras preservadas con ET96 mostraban una mayor tendencia a resultar contaminadas (36.36%) y las preservadas con ARNLT con menor contaminación (6.25%).
• Las medias fueron estadísticamente no significativas con p=0.314 en concentración y 0.228 en pureza.

Figura 15: A la izquierda se muestra la probabilidad media (95% de confianza) de contaminación usando los diferentes métodos de preservación (0=ARNLT; 40=ET40; 96=ET96). A la derecha se muestran los valores desglozados de contaminación según el tipo de preservación y los protocolos de extracción.

Tabla 7: Contaminación (probabilidad) según los métodos de extracción y preservación utilizados; así como las fuentes de contaminación, general, por sales, por proteínas, por sales y proteínas

Figura 20: Comparación de las medias en las concentraciones de ADN según el tipo de tejido.

Figura 21: Comparación de las medias en la relación 260/280 (pureza) de ADN según el tipo de tejido.

Figura 22: Comparación de las medias en las concentraciones de ADN según los estados de descomposición de las muestras.

Figura 23: Comparación de las medias en la relación 260/280 (pureza) de ADN según los estados de descomposición.

• (García y otros, 2008). Utilización de resina Chelex en la extracción de ADN de varios tipos de tejidos de la tortuga marina Caretta caretta, para la amplificación de marcadores moleculares.
• (Krestoff y otros, 2021). Mitochondrial DNA Evaluation and Species Identification of Kemp’s Ridley Sea Turtle (Lepidochelys kempii) Bones After a 3-Year Exposure to Submerged Marine and Terrestrial Environments

• (Krestoff y otros, 2021). Mitochondrial DNA Evaluation and Species Identification of Kemp’s Ridley Sea Turtle (Lepidochelys kempii) Bones After a 3-Year Exposure to Submerged Marine and Terrestrial Environments

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Tabla 8: Indicaciones de peligrosidad de los reactivos con algún grado de peligrosidad.

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Análisis y discusión de resultados

Anexos

Tabla 10: Metadatos con los criterios usados para la identificación de las especies.

Método de extracción:

• Concentración de ADN: GS con 120 ± 73.85 ng/µL (p=0.000, ANOVA, si p < 0.05, tiene significancia ).
• Pureza (260/280): NaCl con 1.64±0.25 (p=0.043, ANOVA).
• Otros autores han usado Chelex 10%, kits de extracción, Proteinasa K, Colagenasa Tipo II, Buffer TE, fenol-cloroformo.

Método de preservación:

• Concentración de ADN: ET40 con97.51 ± 57.14 ng/µL (p=0.314, ANOVA ).
• Pureza (260/280): ARNLT con 1.64±0.25 (p=0.228, ANOVA).
• El método más utilizado es ET96 y algunas veces, buffer de lisis TE o congelados.
• Se reporta por primera vez el uso de ARNLT y ET40 en análisis genéticos de tortugas marinas.

Viabilidad de los protoclos utilizados.

• El método de extracción más viable según los criterios evaluados para carne de tortuga marina en estado de descomposición fue GS, seguido del NaCl y finalmente GSC.
• El preservante más conveniente resultó ser ARNLT seguido de ET40 y por último, ET96.

Costos de reactivos.

• El método más caro es NaCl por la presencia de proteinasa K.
• No hay una diferencia significativa en los costos de GS y GSC.
• El preservante más caro es ARNLT.
• No hay una diferencia significativa en los costos de ET40 y ET96.

Peligrosidad de reactivos.

• La proteinasa K en el método de NaCl lo hace el más peligroso para el manejo del operador y medio ambiente.

Tabla 9: Posición de los métodos de extracción (arriba) y preservación (abajo), siendo 1 el valor más conveniente y 3 el método menos conveniente según los criterios.

Comparación de las medias en las concentraciones de ADN según los métodos de extracción aplicados.

Figura 16: Comparación de las medias en las purezas 260:280 de ADN según los métodos de extracción aplicados.

Figura 17: Comparación de los valores de pureza de ADN obtenidos por otros autores aplicando los protocolos de extracción en muestras de distinta procedencia y tejidos

Comparación de los valores de concentración de ADN obtenidos por otros autores aplicando los protocolos de extracción en muestras de distinta procedencia y tejidos

Figura 18: Comparación de las medias en las concentraciones de ADN según los métodos de preservación aplicados

Figura 19: Comparación de las medias en la relación 260/280 (pureza) de ADN según los métodos de preservación aplicados.

Figura 24: Precio por muestra de los protocolos de extracción de ADN.

• (Madduppa y otros, 2019). DNA barcoding of sea turtles (Dermochelyidae and Cheloniidae) and its protocol using different tissues quality: implication to conservation managers.
• (Pertiwi y otros, 2020). Forensic genetic case study: Species identification and traceability of sea turtle caught in illegal trade in Bali, Indonesia.
• (Valdés, 2015). Filogeografía de las Poblaciones de Tortuga Verde (Chelonia mydas) del Ecuador
• (En calada y otros, 1994). Forensic Applications of Mitochondrial DNA Markers: Origin of a Confiscated Green Turtle.
• (Nishizawa y otros, 2018).Comparison of the rookery connectivity and migratory connectivity: insight into movement and colonization of the green turtle (Chelonia mydas) in Pacific–Southeast Asia.
• (Krestoff y otros, 2021). Mitochondrial DNA Evaluation and Species Identification of Kemp’s Ridley Sea Turtle

• (Ríos-Sanchez y otros, 2016). Análisis comparativo de diferentes métodos de extracción de DNA y su eficiencia de genotipificación en población mexicana.
• (Rodríguez, 2017). Análisis comparativo de tres protocolos de extracción de ADN en cangrejo azul Cardisoma crassum,
• (Escalante, 2020). Efecto de la temperatura en la amplificación del Gen 18S ARNr de dos microalgas a través de la reacción en cadena de la polimerasa PCR.

Figura 25: Precio por muestra de los métodos de preservación y de extracción, en conjunto.

• MSDS. (2023). Indicaciones de peligro.

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