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APLICACIÓN DE UN MÉTODO ALTAMENTE SENSIBLE CON eDNA PARA LA DETECCIÓN DEL CAZÓN PICUDO (ISOGOMPHODON OXYRHYNCHUS) EN TRINIDAD Y TOBAGO
Ana Manzanillas
Francesco Saltos
INTRODUCCIÓN
¿Cerca de la extinción?
- El cazón picudo es una especie en peligro de extinción.
- Es una de las especies que ocupan las áreas más estrechas del mundo, con registros de ocurrencia al sur del estado de Maranhão en Brasil y al noroeste de Trinidad y Tobago, nunca confirmado.
Objetivo general
Determinar la presencia de Isogomphodon oxyrhynchus en las islas Trinidad y Tobago mediante eDNA.
- eDNA ofrece mayor sensibilidad para detectar la presencia de especies raras al tiempo que niegan la necesidad de capturar, manipular o incluso observar las especies objetivo.
- Localizar a la especie.
- Implementación de estrategias de manejo efectivas.
Extensión de su manto dentro de cada cámara.
Cordón tisular que transporta sangre muy salada.
- Por medio de ósmosis, el agua dentro de las cámaras se difundía y se filtraba aire.
H2O H2O H2O H2O H2O
Na+ Cl-
H2O H2O H2O H2O H2O
METODOLOGÍA
LUGAR DE MUESTREO
- En cada sitio de muestreo, se obtendrán 20 muestras de agua preferiblemente turbia entre 5-25m.
Colección y filtrado
Colección: Cada muestra será colectada en una botella Niskin de 5 L previamente limpiado en una solución de lejía al 10% y desinfectado con luz UV durante 20min
Filtrado: Cada muestra de agua se filtrará al vacío con filtros de nailon de 0,8 μm de 47 mm de diámetro
IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES
Extracción
Almacenamiento y extracción de ADN.
Las muestras se almacenarán en etanol a 100% y a -20 ° C.
El QIAGEN® DNeasy® Blood & Tissue Kit es una opción frecuente para estudios de eDNA.
- Se cuantificará en Nanodrop 2000 (ThermoFisher) y se visualizará en electroforesis en gel de agarosa al 2%.
AMPLIFICACIÓN
AMPLIFICACIÓN POR DdPCR
Se usarán primers especie-específicos basados en el gen ITS2 desarrollados por Natchigall et al, 2016: Isogoxy-610-ITS2 5’-CGG CCC CCT CCT GGC TG-3’
AMPLIFICACIÓN POR DdPCR
- Concentraciones de cebadores: 300-1.000 nM y sonda interna :100-250 nM.
- 30-40 ciclos a 0,5 –2,0 ° C / s.
- Temperatura de anneling: 54–66 ° C.
- Tiempo de elongación: 1–2 min y cantidad de gDNA: 0,2–25,0 ng /ul).
- ddPCR SuperMix: 1X Bio-Rad® para sondas (sin dUTP), 750 nM de cada cebador y 250 nM de sonda, y 1,1 ul de ADN extraído, ajustado a un volumen final de 22 ul con agua de PCR.
AMPLIFICACIÓN POR DdPCR
Se generarán droplets usando Bio- Rad® QX200 ™ AutoDG ™ Droplet Digital ™
PCR: velocidad 1 ° C / s, desnaturalización a 95 ° C durante 10 min, seguido de 35 ciclos de 94 ° C durante 30 s y 56 ° C durante 2 min, seguido de desactivación de la enzima a 98 ° C durante 10 min, y un mantenimiento final a 4 ° C.
Todos los datos de ddPCR se analizarán con BioRad® QX200™Droplet Reader y con los softwares Droplet Reader y QuantaSoft ™
RESULTADOS ESPERADOS
- Se revelará la presencia de I. oxyrhyncus en las muestras de Trinidad y Tobago.
Isogomphodon oxyrhynchus
REFERENCIAS
- Schweiss, Katherine E.; Lehman, Ryan N.; Drymon, J. Marcus; Phillips, Nicole M. (2019). Development of highly sensitive environmental DNA methods for the detection of Bull Sharks, <i>Carcharhinus leucas</i> (Müller and Henle, 1839), using Droplet Digital™ PCR. Environmental DNA, (), edn3.39–. doi:10.1002/edn3.39
- Weltz, K., Lyle, J. M., Ovenden, J., Morgan, J. A. T., Moreno, D. A., & Semmens, J. M. (2017). Application of environmental DNA to detect an endangered marine skate species in the wild. PLOS ONE, 12(6), e0178124. doi:10.1371/journal.pone.0178124