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Estudo do perfil metabólico de cultura 2D e 3D em modelo de metástase espontânea de carcinoma espinocelular de língua
Jéssica Mari Kawashima
Laboratório de bioquímica e biologia molecular do câncer
Orientador: Franklin David Rumjanek
Co-Orientadora: Thaís Oliveira
Introdução
Carcinoma espinocelular de língua
Carcinoma espinocelular de língua
- Representa 60% dos tumores orais
- Crescimento lento, porém agressivo
- Baixa sobrevida em diagnóstico de metástase
- Fatores etiológicos: tabagismo, álcool, falta de higiene bucal e infecção viral
- Tratamento: glossectomia, quimio e radioterapia
Linfonodos
Adaptado INCA, 2017
Modelo de progressão metastática
Modelo de progressão metastática
Desenvolvido pela professora Michele Agostini
60 dias
Linfonodos axilares coletados
SCC-9
SCC-9
ZsG
Balb/c nude
15 dias
Linfonodos axilares coletados
LN-2
ZsG
LN-1
ZsG
Balb/c nude
Potencial de metástase
Expressão de marcadores EMT
Ensaio de Wound Healing
Ensaio de invasão
AGOSTINI, Michele; 2013
x
LN-1
Expressão de N-CAD
Potencial de invasão
Motilidade
LN-2
Expressão de N-CAD
Potencial de invasão
Motilidade
Objetivo
Objetivo
Como interfere?
Cultura 3D
- Exposição heterogênea ao oxigênio e nutrientes
- Mimetiza condições de adesão de tumor solido
Metabolismo
- É a base de qualquer atividade biológica
- Principal função obter energia
Estudar a relação entre o metabolismo energético e a organização celular através da comparação entre culturas 2D e 3D
Ensaios
Maior liberação de calor em células metastáticas 3D
Liberação de calor
(*) p<0,05, (**) p<0,01, (***) p<0,001 e (****) p<0,0001
Contribuição da via glicolítica e oxidativa
Tratamento com inibidores
Tratamento com inibidores
Dependência diferencial de vias produtoras de energia
(*) p<0,05, (**) p<0,01, (***) p<0,001 e (****) p<0,0001
Tratamento com substrato
Adaptado de DEBERARDINIS; Ralph J.
Glicose é essencial para formação e manutenção de cultura 3D
Liberação de lactato
Liberação de lactato inferior à monocamada
(*) p<0,05, (**) p<0,01, (***) p<0,001 e (****) p<0,0001
Adaptado de SANT e JOHNSTON, 2017
Oxigrafia
Consumo de oxigênio aumentado em cultura 2D
(*) p<0,05, (**) p<0,01, (***) p<0,001 e (****) p<0,0001
Liberação de espécie reativa de oxigênio
Espécies reativas de oxigênio (ROS): produzidas pela célula quando esta absorve e metaboliza o oxigênio.
Acúmulo excessivo pode causar danos à integridade celular
Liberação de espécie reativa de oxigênio
Ensaio de liberação de H₂O₂
Não há diferenças significativas de liberação de H₂O₂ entre culturas 2D e 3D
Ensaio de quantificação de MDA
LN-1 (3D) e LN-2 (3D) têm níveis de peroxidação lipídica maiores em relação às LN-1 (2D) e LN-2 (2D)
Malondialdeido: Um dos produtos de peroxidação lipídica
Conclusão
Conclusão
Maior consumo de oxigênio
Dependente de glicose para sua formação
Monocamada
Esferóides
Sensível à presença de inibidores da via oxidativa e glicolítica
Sensíveis à inibição da glicólise
Maiores níveis de peroxidação lipídica
Menor liberação de calor
Os resultados sugerem que apenas o modelo de cultivo celular é suficiente para alterar uma série de parâmetros metabólicos
Qual o modelo de cultivo ideal?
Perspectivas
Produzir células Rho zero para avaliar de maneira geral a contribuição da mitocôndria no modelo 3D e 2D
Avaliar a expressão e atividade dos transportadores de glicose (GLUTs) e lactato (MCTs)
Avaliar mecanismos antioxidantes
Agradecimentos
Laboratório de bioquímica e biologia molecular do câncer
Agências de fomento
Banca examinadora
Atividade enzimática
+
NADP
NADPH
Glicose 6 P
6P6L
Extrato
G6PDH
Atividade enzimática
peroxissoma
Catalase
2 H₂O₂
2 H₂O + O₂
Dependência diferencial de vias produtoras de energia
Tratamento com inibidores
Método colorimétrico MTT
- Análise de viabilidade celular
- MTT reage com desidrogenases mitocondriais
transformação em sais de tetrazólio
cristais azul-arroxeados
- Medição da absorbância
http://2010.igem.org/wiki/images/c/ca/Freiburg10_MTT_method.png
Liberação de lactato
- Meio de reação: piruvato, NAD+ e hidrazina (pH 9,2)
- Absorbância do NADH é quantificada
Presença de hidrazina impede que NADH produzido reaja com o piruvato.
Oxigrafia
Medição em tempo real o consumo de oxigênio das células
Ensaio de liberação de H₂O₂
Detecção do H₂O₂ liberado pelas células
- Peróxido de hidrogênio (H₂O₂).
- Adição de Amplex Red e Peroxidase no meio
- Detecção: fluorescência
Interação entre Amplex Red e o produto
da ação da enzima peroxidase sobre o H₂O₂
Fluorímetro
Ensaio de quantificação de Malondialdeído
Malondialdeido: Um dos produtos de peroxidação lipídica
- Pool com MDA que já estava presente na célula + Causado pelo estresse da maceração
- TBA reage com Malondialdeido emite coloração
- N-Butanol: separa MDA de outros compostos carbonicos liberados por causa da maceração.
- Quantificação leitor de placa
Ácido Tiobarbitúrico