Copia de Análisis molecular GFP

Justificación

Justificación

• GFP y algunos de sus mutantes tienen muchas aplicaciones útiles:
• Detección en tiempo real,
• ausencia de disrupción o toxicidad en las células huésped,
• ausencia de necesidad de cofactores,
• viabilidad de la fusión con las proteínas diana.
• Se han convertido en una de las sondas fluorescentes más utilizadas en biología celular y biología molecular.
• A pesar de esta abundancia de las proteínas fluorescentes de tipo salvaje, la mayoría de los FP como herramientas de imagen se derivan de solo un puñado de estos organismos.

Introducción

Introducción

• La proteína verde fluorescente (GFP) fue descubierta como una proteína compañera de la aequorina, una proteína quimioluminiscente de la medusa Aequorea.
• La GFP está compuesta por 238 aminoácidos y, por lo tanto, es una proteína bastante pequeña con un peso molecular de aproximadamente 27 kDa.
• La excitación a 396 nm da como resultado un máximo de emisión a 508 nm.
• El descubrimiento de GFP condujo a una nueva revolución en la biología molecular.
• Se han diseñado distintos mutantes con múltiples aplicaciones.
• Escherichia coli (E. coli) es un huésped conveniente para la expresión de estas proteínas recombinantes en grandes cantidades y bajos costos de producción.

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Marco teórico

Marco teórico

• La investigación sobre GFP y sus algunos mutantes ha sido bastante acelerada.
• Hasta el momento se han usado siete estrategias para generar mutaciones en GFP:
• Se ha construido una biblioteca en E. coli de genes GFP mutantes.
• Se ha desarrollado un nuevo método para determinar la eficacia mutagénica de un mutágeno sospechoso mediante el empleo de GFP como biosensor directo.
• Se había utilizado la evolución molecular para crear un mutante de GFP que emite luz roja con máximos de excitación y emisión a 555 y 585 nm, respectivamente.
• Se ha reportado también en azul, cyan y amarillo.

Metodología

Metodología

• En el software de análisis bioinformático GeneiousPrime® 2021.0.3, se realizó una búsqueda generalizada colocando los nombres de las fotoproteínas (Aequorina, clitina y obelina) y las proteínas GFP respectivas para aquellas especies: A. victoria, C. gregaria y O. geniculata.
• Se realizó el alineamiento con 65% de similariad.
• Para una mejor representación de las interacciones entre estas dos proteínas, se diseñó in silico la estructura de cada una de las secuencias.
• Se diseñó el proceso de bioluminiscencia.

Análisis y discusión de Resultados

Los cambios en el potencial de acción activan los canales de Calcio dependientes de voltaje. Los fotocitos con los canales bloqueados emiten bioluminiscencia.

Clitina

Aequorina

Obelina

Una vez unida la celenterazina a la proteína en forma de 2-hidroxiperoxicelenterazina, sufre cambios conformacionales y se produce celenteramida excitada, luz y CO2.

Resultados

Los dominios que interactúan entre las dos proteínas inducen cambios en las propiedades químicas de los aminoácidos.

• Los fluoróforos de clitina y Clytia GFP se encuentran a 45 Å de distancia, por lo que ocurre una superposición espectral favorable.
• Es decir, la absorbancia de Clytia GFP coincide con el espectro de emisión de la clitina.
• Existe una transferencia de energía eficiente desde el estado excitado de la celenteramida al fluoróforo de Clytia GFP mediante el mecanismo FRET (Transferencia de Energía de Fluorescencia por Resonancia).

Clytia GPF

Renilla GFP

Aequorea GFP

Los iones de Ca2+ se unen en los dominios "EF HANDS" I, III y IV. El II no posee la secuencia canónica en el loop que le permite unirse al Ca2+.

Los residuos básicos (K11, K13, K100 y K104) introducen carga positiva en la interfaz de la clytina, y la complementariedad con ella se encuentra en el bucle acídico S10-S11 de Clytia GFP, compuesto por residuos D211, D213, D214, D215 y E216. Aparte de las fuerzas electrostáticas, la complejación se rige por una serie de contactos hidrófobos y una red de enlaces de hidrógeno.

Interacción de los homodímeros

Fotoproteínas

GFPs

Conclusiones

• El estudio de las proteínas involucradas en la bioluminiscencia resulta importante para perfeccionar el uso de las mismas herramientas biotecnológicas.

Conclusiones

Bibliografía

Bibliografía

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