Microbiologia

Información del microorganismo

INFORMACIÓN

La muestra del hisopado nasal fue recibida luego de haber sido trasladada y fue conservada a 4°-6°C. De esta manera evitamos un crecimiento excesivo de la flora acompañante y mantuvimos viables los posibles patógenos.

Ante la situación que se nos presentó, en la cual no se comentaba un posible riesgo zoonótico o de contagio de la infección, decidimos trabajar en un laboratorio de bioseguridad de tipo 1, ya que tuvimos presente que existe un microorganismo patógeno para el animal pero con un potencial mínimo de riesgo o riesgo individual y comunitario escaso o nulo. Es importante tener la orden y/o la ficha clínica, fecha de la toma de la muestra, el personal del laboratorio debe también anotar la fecha en que la muestra ha llegado y todos los datos requeridos para el seguimiento.

ACONDICIONAMIENTO DE MATERIALES Y ENTORNO DE TRABAJO

ACONDICIONAMIENTO

Al comenzar a trabajar en nuestra marcha bacteriológica debimos acondicionar tanto los materiales que usamos como el lugar en el que trabajamos. Por lo tanto nuestro punto de partida fue tener los materiales previamente esterilizados. Utilizamos placas de Petri en este caso, descartables, que fueron esterilizadas en la autoclave (120 ° C, 1 atm, 20 minutos). También limpiamos y esterilizamos el porta y cubre objetos y por ultimo desinfectamos la mesada de trabajo con un desinfectante de amplio espectro asegurándonos que no haya contaminación alrededor.

NO OLVIDAR QUE EL PRIMER PASO ES EL LAVADO DE MANOS.

OBSERVACIÓN DIRECTA Y TINCIÓN

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PRIMER

PASO

Homogeneizamos el cultivo, esterilizamos el ansa sobre la llama del mechero de Bunsen y enfriamos (previo a esto introdujimos el hisopo con la muestra en solución fisiológica). Embebimos la muestra y la extendimos en el porta objetos, luego secamos (con la llama) y por ultimo fijamos (también, pasando sobre la llama un par de veces). Posterior a este paso teñimos nuestra muestra con la coloración diferencial GRAM, de esta manera pudimos observar su tinción (para diferenciar gram positivismo o no), morfología y agrupación. En nuestra observación directa observamos abundantes BACILOS GRAM NEGATIVOS con agrupación de estreptobacilos. Debemos tener en cuenta que uno de los factores de virulencia que más se destacan en los bacilos GRAM NEGATIVOS se relaciona con su pared celular, que tiene en su conformación el LIPOPOLISACARIDO o LPS. En él se encuentra el antígeno O y endotoxina de la bacteria.

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SIEMBRA

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SEGUNDO

PASO

Para realizar la siembra tuvimos que preparar nuestro medio de cultivo. Para esto debimos preguntarnos qué metabolismo suponíamos que tenía nuestro microorganismo. Por las características que observamos y los datos obtenidos a partir de lo que el veterinario nos informó, pudimos suponer que se trataba de un microorganismo quimioheterótrofo, que se reproducía en pH neutros, que la temperatura ideal para su cultivo era de 37° (mesófilo), entre otras cosas. Partiendo de esta base pudimos seleccionar un medio de cultivo adecuado, en este caso seleccionamos el medio AGAR MC CONKEY, que es un medio SELECTIVO-DIFERENCIAL. Con este medio evitamos el crecimiento de aquellas colonias de bacterias que no nos interesaban, por ejemplo, GRAM-POSITIVAS, y además contiene lactosa como sustrato atacable y un indicador de pH que vira su color si son fermentadoras. No fue el caso.

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CULTIVO

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TERCER

PASO

Ahora debimos procurar que la átmosfera de cultivo sea la adecuada para nuestro microorganismo. Como ya mencionamos, dijimos que nuestro microrganismo se desarrolló en el interior del animal y toleraba temperaturas de 37°. Con esto supusimos que era mesófilo. Si hubiésemos querido ahondar en detalle y saber si nuestro microorganismo era aerófilo, aerotolerante, anaerobio estricto o anaerobio facultativo podríamos haber realizado un cultivo en un caldo (pudo ser caldo Mc Conkey) colocado en una estufa e incubado a 37° durante 24hs. Una vez pasado ese tiempo, si observábamos el desarrollo de las colonias y dependiendo si se desarrollaban en la superficie, en profundidad, en todo el tubo de ensayo o casi llegando a la superficie, pudo haber sido una bacteria aerobia estricta, anaerobia estricta, anaerobia facultativa o microaerobio, respectivamente. En nuestro caso, el microorganismo era aerobio estricto y se desarrollaba a una temperatura de 37° en 24hs. Su tiempo generacional fue corto, es decir se dividió y duplicó su población en poco tiempo (20 minutos aproximadamente).

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REAISLAMIENTO Y PRUEBAS BIOQUIMICAS

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CUARTO

PASO

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Una vez desarrolladas las colonias nos encontramos con el desarrollo de distintas bacterias en nuestro medio de cultivo. Por esto debimos realizar un reaislamiento de nuestra bacteria en estudio, su posterior observación y cultivo en un nuevo medio, el cual puede ser el mismo previamente utilizado, AGAR MC CONKEY. Hay que tener en cuenta que siempre que se trate de estos procedimientos es importante mantener nuestro lugar de trabajo limpio y estéril (lavarse las manos y trabajar siempre al abrigo de la llama)

Ya reaislada nuestra bacteria pudimos proceder a realizar pruebas bioquímicas que son las distintas pruebas que nos permitieron identificar el género y la especie con la que estábamos tratando. Es importante destacar que deben estar reaisladas, en fase exponencial y en un medio de cultivo apropiado. Como ya mencionamos previamente, se trataba de un BACILO GRAM NEGATIVO. Las pruebas que pueden realizarse son, catalasa, oxidasa, coagulasa, indol, INVIC, entre otras. Con esta información obtenida pudimos informarle al veterinario que bacteria estaba causando la infección.

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ANTIBIOGRAMA POR DIFUSIÓN

Además de realizar pruebas bioquímicas para nuestra bacteria (en cultivo puro), realizamos las pruebas de susceptibilidad. Estas pruebas nos van a ayudar a averiguar que anntibiotico es el correcto para evitar la propagación del microorganismo o eliminarlo de nuestro paciente en cuestión.

Para la prueba de susceptibilidad realizamos un ANTIBIOGRAMA DE DIFUSIÓN. Tuvimos que preparar el inoculo y el medio que utilizamos, en este caso, Agar Muller Hinton (pH controlado, entre 7,2-7,4; de 25 a 30 ml en una placa de no más de 4mm de altura). Además estandarizamos la densidad del inoculo. Lo que hicimos fue tomar colonias aisladas de una placa de cultivo no selectivo (vamos a realizar un reaislamiento en un cultivo no selectivo como puede ser agar cerebro corazón, lo cultivamos durante 24hs a 37° y obtenemos nuestro cultivo fresco) con un ansa de alambre, se introdujo en 5 ml de solución fisiológica estéril y se equiparó su turbidez con el tubo de 0,5 Mc Farland. Luego de esto sembramos el inoculo en el Agar Muller Hinton. Colocamos el disco con antibiótico que elegimos con una pinza estéril sin ejercer mucha presión sobre él e incubamos por 18-20hs en estufa a 35°. Se respetó una distancia suficiente entre discos para que no hubiera superposición del halo. Luego de la incubación procedimos a medir los halos de los antibióticos. En el caso de nuestra bacteria presentaba resistencia a los amino- glucósidos (relacionada con la impermeabilidad adquirida de la bacteria), a los beta-lactámicos (por secreción de beta lactamasas y sus porinas) y a los macrólidos (suponemos por modificación del sitio blanco). Todo esto mencionado anteriormente se debe a resistencias adquiridas de la bacteria en estudio. Bien pudo haberse dado por mutaciones (espontaneas o no espontaneas) o por plásmidos que codifican esta información genética y le dan mayor resistencia a la bacteria. A los antibióticos que no ofreció resistencia fueron a la NORFLOXACINA, CIPROFLOXACINA y LEVOFLOXACINA, quinolonas que actúan como bactericida y se destacan porque su mecanismo de acción es sobre la inhibición de la síntesis de ácido nucleico

Antibiótico

VACUNA

Por último nos pidieron que creáramos una vacuna para protección futura. Como primera medida seleccionamos los animales para realizar las puerbas necesarias, inoculandolos con las bacterias atenuadas. En nuestro caso seleccionamos animales exocriados (no aparentados entre sí) y miroxénicos (animales criados en laboratorio bajo condiciones sanitarias estrictas y establecidas). Como especie animal seleccionamos cobayos. Utilizamos como método el envejecimiento de los cultivos y las temperaturas disgenésicas al igual que Louis Pasteur en sus ensayos para las vacunas contra el cólera de los pollitos y el ántrax respectivamente. Finalmente luego de varios ensayos obtuvimos, por envejecimiento del cultivo la vacuna más efectiva contra nuestro microbio en cuestión. Al final se procede a realizar la eutanasia en los animales con los que trabajamos.

Tener en cuenta que a lo largo del trabajo se realizaron varias incubaciones, preparación de medios de cultivo y ensayos que podrían contaminar el ambiente de trabajo. Teniendo esto presente es importante destacar que cada material utilizado en el laboratorio, previo a su uso, debe estar bien esterilizado y nuestro entorno en el cual trabajamos desinfectado de manera correcta. Todos los materiales descartables podrán ser descartados en bolsas especiales luego de su esterilización. Debe haber una correcta clasificación de los materiales descartables (residuos domésticos, especiales o infecciosos) para no contaminar el medio ambiente ni generar peligro a los trabajadores implicados en la recolección de estos residuos patológicos

A TENER EN CUENTA