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Transcript

Tecnologia del DNA ricombinante

Simona Brilli

Definiamo tecnologia del DNA ricombinante l'insieme delle tecniche di laboratorio che consentono di isolare e tagliare sequenze di DNA per trasferirle nel genoma di altre cellule.

Alla base delle biotecnologie

1928 Alexander Flamming:

scoperta della penicillina

Alla base della moderna biotecnologia

1953

Watson e Francis Crick:

struttura a doppia elica

del DNA.

La biotecnologia nasce insieme alla civiltà umana, i primi indizi dell'uso di lieviti per fermentare la birra risalgono a 4000 anni fa nella civiltà sumera. Tali processi fanno parte della biotecnologia classica.

Quando nasce

1963 Edward L.Tatum:

Definì l'eugenica, l'ngegneria genetica e l'ingegneria Eufenica.

Tuttavia, il termine "biotecnologia" venne usato per la prima volta all'inizio del Novecento in riferiento a tecniche di manipolazione del DNA; ma i primi passi vennero mossi solo nella seconda metà del '900.

1959 Primo sequenziamento del genoma di un organismo vivente.

1997 Dolly:

la prima pecora clonata da cellule adulte

Step concettuali

Come funziona

  • Identificazione di un gene
  • Taglio e isolamento della molecola di DNA
  • Unione del gene a un vettore a sua volta costutuito da DNA
  • Trasferimento all'interno di una cellula ricevente

Preparazione del frammento

Taglio e isolamento di un gene

Osservare la natura

Taglio

Nel 1960 venne scoperto che alcuni batteri producono degli enzimi, denominati di restrizione, con lo scopo di ridurre in frammenti piccoli e non infettanti il DNA estraneo.

Enzimi di restrizione

In un processo chiamato digestione da restrizione, spezzano i legami tra il gruppo ossidrile 3' e il gruppo fosfato 5', producendo tagli sfalsati.

Enzimi di restrizione

Ogni tipo di enzima taglia su una specifica sequenza di basi, di solito palindroma, detta sito di restrizione.

Vantaggio: trattando un campione di DNA con uno di tali enzimi, e ammettendo che siano stati tagliati tutti i siti di ric., si produce sempre la stessa serie di frammenti.

Come selezionare il frammento utile

Isolamento

I frammenti di restrizione hanno lunghezze diverse; ciò permette di separarli tramite elettroforesi su gel e di marcare il frammento di interesse.

Elettroforesi su gel

Una sequenza nota è messa in evidenza con una sonda di DNA radioattiva. Il campione di DNA viene denaturato quando è ancora nel gel. In seguito, il campione viene esposto a una sonda di DNA a singolo filamento contenente una sequenza complementare a quella cercata. A ibridazione avvenuta, una macchia di radioattività indicherà il punto in cui la sonda ha intercettato la sequenza di DNA desiderata.

Viene fatto solidificare un gel a forma di lastra con dei pozzetti, su cui si depongono i campioni di DNA. Alle due estremità del gel si applica un campo elettrico con il polo negativo vicino ai pozzetti: grazie alla presenza del gruppo fosfato il DNA è carico negativamente e migra. Il gel funge da setaccio molecolare e i frammenti più brevi migrano più velocemente

Inserimento nella cellula

Unione ad un vettore e trasferimento

Quando si inserisce nuovo DNA all’interno di una cellula si vuole che questo si duplichi quando la cellula si divide. Per potersi duplicare, il nuovo DNA deve entrare a far parte di un replicone, cioè di un segmento di DNA che contenga un’origine della duplicazione.

Metodi

Un frammento di DNA appena inserito si può integrare in un replicone in due modi:

  • Dopo essere penetrato nella cellula, il frammento si può inserire in un cromosoma ospite in prossimità di un sito di origine della duplicazione. Evento casuale.
  • Il frammento di DNA può entrare nella cellula ospite mediante una sequenza di DNA trasportatrice, un vettore, che possiede già un’origine della duplicazione adatta.

Caratteristiche di un buon vettore

Vettori

  • duplicarsi in modo indipendente nella cellula ospite;
  • possedere una sequenza di riconoscimento per un enzima di restrizione che lo possa tagliare e combinare con il nuovo DNA;
  • contenere un gene reporter che ne segnali la presenza nella cellula ospite;
  • avere dimensioni minori dei cromosomi dell’ospite.

3 opzioni caratteristiche

Opzioni in uso

Plasmidi

PRO

Plasmide

  • Piccole dimensioni (plasmide di E. coli: 2000-6000 coppie di basi | cromosoma principale: oltre 4,6 milioni);

  • Unica sequenza di riconoscimento per un enzima di restrizione -> trasformazione in molecola lineare con di estremità coesive;

  • Geni reporter, es. resistenza antibiotici;

  • Duplicazione indipendente.

  • Sono troppo piccoli per la maggior parte dei geni eucariotici.

CONTRO

Virus

I virus vengono frequentemente usati come vettori per i geni eucariotici e procariotici. Dal momento che per un virus infettare le cellule è un fatto naturale, non richiedono particolari artifici per essere indotti a penetrare nelle cellule ospiti.

Cromosomi artificiali di lievito

Problema: il DNA eucariotico utilizza un’origine della duplicazione differente dal DNA procariotico.

Contengono l’origine della duplicazione del lievito, le sequenze del centromero e del telomero, il che li rende un vero e proprio cromosoma eucariotico. Contengono, inoltre, siti di restrizione e geni reporter sintetizzati artificialmente.

Possono accogliere l’inserimento di segmenti lunghi da 50000 fino a 1,5 milioni di coppie di basi.

Applicazioni

  • Agricoltura (specie resistenti, caratteristiche nutrizionali potenziate)
  • Bioinformatica
  • Interferenza RNA (microRNA, premio Nobel Mello e Fire 2006)

Prospettive

Rischi

  • Immissione di allergeni nella catena alimentare
  • Resistenza agli antibiotici
  • Conseguenze su specie indesiderate
  • Diminuzione della biodiversità
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