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[Stratégie] Traitement de la sclérose en plaques par stimulation de la remyélisation par les récepteurs LXR-alpha
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Traitement de la sclérose en plaques par stimulation de la remyélinisation
par les récepteurs nucléaire LXR-alpha
Marina ACHARD
Silène ANGEBAUD
Julie ATHOMAS
Julie BODILIS
Natacha CADUC
Fanny COLARD
Nicolas FOUQUET
La sclérose en plaques
épidémiologie de la maladie
Le patient type est plutôt une femme (75% des cas) qui aura sa première poussée entre 25 et 35 ans.
*
Il n'existe, à ce jour, aucun traitement curatif de la sclérose en plaques !
* Atlas of multiple sclerosis, 2013
Schéma : Apparition d'une lésion ou dégradation de la myéline pas le système immunitaire.
La sclérose en plaques
Définitions
En 1868, le neurologiste français Jean-Martin CHARCOT définit pour la première fois cette pathologie.
- Maladie neurodégénative
- Maladie auto-immune
La sclérose en plaques
Les cibles majeures
Nous allons nous intéresser à des récepteurs qui sont impliqués dans le processus de (re)myélinisation* : les récepteurs LXR-alpha
(2) Booster la production de myéline par les oligodendrocytes
Notre stratégie
(1) Bloquer avec
immuno-régulateurs ou immunosuppresseurs
Attaque du système
immunitaire
(Lymphocytes B et T)
* D. Meffre et coll. Liver X receptors alpha and beta promote myelination and remyelination in the cerebellum. Proc Natl Acad Sci USA, édition en ligne du 26 mai 2015
Les récepteurs LXR-alpha
Définition
- Codés par le gène NR1H3 (chromosome 11)
- Non ubiquitaires contrairement aux LXR-bêta !
La protéine codée par ce gène appartient à la sous-famille NR1 de la superfamille des récepteurs nucléaires. Les membres de la famille NR1 sont des régulateurs clés de la fonction des macrophages, contrôlant les programmes de transcription impliqués dans l'homéostasie des lipides et l'inflammation.
Structure 3D d'un récepteur nucléaire LXR-alpha
Les récepteurs LXR-alpha
Mécanisme d'action
- Formation d'un hétérodimère avec le récepteur X des rétinoïdes (RXR)
- LXRs régulent l'expression des gènes cibles, favorisant la myélinisation et la remyélinisation et diminuant la neuroinflammation [1]
- LXRs régulent l'homéostasie du cholestérol dans les oligodendrpocytes [2]
[1] Meffre D, Shackleford G, Hichor M, et al. Liver X receptors alpha and beta promote myelination and remyelination in the cerebellum. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112(24):7587–7592. doi:10.1073/pnas.1424951112
[2] Nelissen, K., Mulder, M., Smets, I., Timmermans, S., Smeets, K., Ameloot, M. and Hendriks, J.J. (2012), Liver X receptors regulate cholesterol homeostasis in oligodendrocytes. J. Neurosci. Res., 90: 60-71. doi:10.1002/jnr.22743
Les récepteurs LXR-alpha
Mécanisme d'action
- moelle épinière
- corps calleux
- nerf optique
- cervelet
gènes de la myéline
(PLP et MBP)
Quand il y a une activation du récepteur nucléaire LXR-alpha, alors
il y a une modulation de la différenciation de la quantité d'ARNm des gènes PLP et MBP.
Mouzat K, Chudinova A, Polge A, et al. Regulation of Brain Cholesterol: What Role Do Liver X Receptors Play in Neurodegenerative Diseases?. Int J Mol Sci. 2019;20(16):3858. Published 2019 Aug 8. doi:10.3390/ijms20163858
Ghjuvan Ghjacumu, Shackleford, Julien Grenier, Walid Abi Habib, Charbel Massaad, Delphine Meffre. Liver X Receptors differentially modulate central myelin gene mRNA levels in a region-, age- and isoform-specific manner. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology
Volume 169, May 2017, Pages 61-68.
Phase 1 : Screening sélectif
Quelques exemples de ligands connus :
2,5 hydrosycholestérol,
TO 9001317 synthétique,
epoxycholesterol, oxystérol...
Screening virtuel basé sur :
- La connaissance du récepteur
- L'affinité du récepteur pour les dérivés du cholestérol
Topic
Chemo-profiling :
- Mesure du potentiel de sensibilité
- Preuve de concept
- Etude de mécanisme d’action
Sélection d'une banque de molécules candidates
Phase 2 : Recherches précliniques - Principe des Tests à échelle cellulaire
LXR-alpha
Myelin Basic Protein
(MBP)
Polypeptid Protein
(PLP)
Quantification des ARNm des gènes MBP & PLP après ajout des molécules candidates
Insertion des dérivés de cholestérol et comparaison
5
Préparation du vecteur plasmidique
- Molécule candidate déposée dans les puits
- Comparer TOUS les résultats de test pour CHAQUE molécule candidate
- Retenir le dérivé qui a la plus forte expression de MBP/PLP
1
- Vecteur puc19 car 2686pb
- Enzymes de restrictions
Dosage de l'ARNm et
comparaison
4
2
Culture cellulaire
3
- Culture d’oligodendrocytes
- Insertion du gène vecteur
- Extraction ADN/ARN
- Spectrométrie d’absorption avec ratio ADN sur ARN
- Différence significative sain/malade
Vérification de l'intégration
du plasmide
Par fluorescence : DREADDS/cre-lox/GFP
Phase 2 : Recherches précliniques - Principe des Tests à l’échelle tissulaire
Utilité de tests histologiques :
- Etudier la démyélinisation et la remyélinisation en laboratoire
- Comparer l'effet des molécules d'intérêts sur la remyélinisation
- Limiter les pertes animales
Développement des tissus neuronaux
Du développement tissulaire...
Une co-culture va permettre la myélinisation de l’axone en laboratoire et ainsi il sera possible d’étudier notre modèle tissulaire pour des tests de démyélinisation et de remyélinisation
Les tests à l'echelle tissulaire
Il existe 2 types de tests tissulaires pour étudier la démyélinisation et la rémyélinisation :
... aux tests tissulaires
Coloration au bleu Luxol
Coloration au bleu Luxol (pour le système nerveux central)
- Identifier les structures neuronales basiques dans le cerveau et la moelle épinière
- Utilisée pour visualiser la myéline dans le tissu nerveux (composé de myéline + substance blanche (axones)).
- Basée sur une réaction acide-base simple
- Colorant phtalocyanine de cuivre sulfoné
Soluble dans l'alcool + attiré par les bases contenues dans les phospholipides de la myéline
→ La myéline est colorée en bleu – vert
→ Les neurones sont colorés en violet
Exemple de résultats des tests réalisés avec du bleu Luxol
Coloration au Noir de Soudan
Coloration au Noir de Soudan (pour les lipides)
- Destinée à la visualisation des lipides (phospholipides, stérols, triglycérides neutres)
- Peut également être utilisée pour la coloration des chromosomes, de l'appareil de Golgi et des granules des leucocytes.
- Cette famille de colorants forment un groupe de colorants des lipides solubles dans les solvants.
→ La myéline sera de couleur bleue-noire,
→ Les zones avec absence de myéline seront blanches
→ Les zones de remyélinisation seront colorées en gris
Phase 2 : Recherches précliniques - Tests à l’échelle de l’organisme
- Modèle animal: souris LXR dKO
LXR
Quantification de la myéline par différents tests
Démyélinisation
LXR
Provenance des animaux: Souris LXR dKO, CNRS de Clermont-Ferrand
Résultats attendus
LXR
Remyélinisation
Abscence de myéline
Quantification de la myéline
Nouvelle méthode d’imagerie
par Bruno Stankoff et Catherine Lubetzki
2 Radiotraceurs
[11C] flumazenil
[11C] PiB
Visualisation de la démyélinisation
Visualisation de la remyélinisation
Quantification de la dégénérescence des neurones.
Fixation sur les récepteurs GABA-A spécifiques des neurones.
Fixation sur la myéline de la substance blanche
Phase 3 : Développement Galénique
Difficultés :
- Il faut que le médicament passe les membranes pour entrer dans le noyau
- Attention aux EPP : voie per os pas nécessairement idéale
- Récepteur nucléaire
- Exprimé dans le foie et l'intestin
Topic
+
Mise au point et caractérisation des formulations de produits finis médicamenteux
Transposition d’échelle de la formule galénique et du procédé de fabrication vers le site
de production industrielle.
- Préformulation : études physicochimiques de la molécule active
- Formulation : élaboration d'une forme pharmaceutique adaptée à l'administration du produit, à la posologie prévue, présentant les meilleures garanties possibles d'activité, de stabilité, d'acceptabilité et d'innocuité
+ Elaboration du procédé (transposition de la fabrication à l’échelle industrielle)
Phase 4 : Principe des Tests de Toxicologie
Pourquoi réaliser des tests de toxicologie ?
- C'est une étape obligatoire pour savoir si la molécule candidate est toxique sur l'organisme animal avant son administration chez l'homme en phase clinique.
Les différents test à réaliser
- toxicité par administration unique et réitérée
- génotoxicité in vitro et in vivo
- cancérogénicité
- reprotoxicité
Le laboratoire Phycher Bio Développement propose d'effectuer l'ensemble des tests nécessaires à l'étude toxicologique de molécules
Pour chaque test, faire des analyses anatomo-pathologique sur tous les tissus où LRX-alpha est aussi exprimés
Phase 5 : Essais Cliniques
- Etude Randomisée, Multicentrique, Double aveugle en Plan Parallèle
- Dans des centres disposant d'IRM pour mesurer l'évolution de la remyélinisation
Topic
Note : on ne peut faire que des études contre placebo parce qu'il n'existe pas de produit de référence.
Critères d'inclusion
Forme rémittente: la maladie évolue par poussées successives.
Cette forme débute vers 25/35 ans et représente 85 % des formes de début.
Les poussées peuvent survenir à une fréquence variable, selon chaque patient, allant de plusieurs poussées par an à des poussées espacées de plusieurs années.
Critères d'inclusion et d'exclusion
- Patients atteints de sclérose en plaques non progressive selon McDONALD (critères de diagnostic de sclérose en plaques)
- Pas de grossesse ou de désir de grossesse
- Consentement éclairé signé obtenu par le patient et son représentant légal
- Premières manifestations neurologiques avant le début de l'étude
- Données disponibles sur le patient: nom, prénom, date et lieu de naissance, numéro de sécurité sociale
Critères d'exclusion
- Patients atteints d'une forme progressive de SEP
- Antécédents de tumeur maligne, d’allergie sévère, de réaction anaphylactique ou d’allergie médicamenteuse, d’infection par le HIV ou d’immunodépression
- Varicelle, zona ou toute infection sévère dans les 6 semaines précédant l’inclusion
- Infection par le virus de l’hépatite B ou de l’hépatite C
- Antécédents d’infarctus du myocarde, AVC ou maladie veineuse thrombo-embolique
- Antécédents de cancer du sein ou de l’utérus
- Défaillance hépatique sévère ; hémorragie génitale inexpliquée
- Désir d’allaitement ; désir d’un traitement immuno-actif conventionnel pour la SEP dans les 24 semaines suivant l’accouchement ; refus d’une contraception non-hormonale dans les 12 semaines suivant l’accouchement
Critères d'exclusion
Critères d'évaluation CLINIQUES
Vitesse de Traitement de l’Information
Fonctions Exécutives
Attention
Mémoire Visuelle
Mémoire Verbale
Tests Cognitifs
IRM
Amélioration de la Qualité de Vie
Critères d'évaluation
Amélioration de différents critères:
- Evaluation de la santé et de l'activité physique, de la santé mentale, du bien être social et émotionnel
- Selon l'échelle Short Form-36 Health Surve (SF 36)
- Batterie de 8 tests appelée BCcogSEP
- Evaluant les principales fonctions touchées
- Dépistage rapide
- Mesure de la sévérité
- Charge lésionnelle (nombre de lésions)
- Activité lésionnelle (Reflet de l'activité inflammatoire)
- Degré d'atrophie
Conclusion générale
- De nombreuses investigations seront en place pour sélectionner la molécule thérapeutique parmi plusieurs molécules candidates. Celle-ci est capable de produire un résultat thérapeutique satisfaisant avec une balance bénéfice/risque positive. A travers cette étude l'affinité, l'efficacité et la sélectivité d'un lead sera démontré.
- Les étapes de screening sélectif auront permis d'affiner la sélection des molécules candidates.
- Grâce aux expériences menées en recherche fondamentale, l'efficacité des molécules sera testée et comparée.
- La molécule thérapeutique aura prouvé :
- sa non-toxicité sur l'homme (études toxicologiques)
- son efficacité thérapeutique (essais cliniques)
- Si une AMM lui est délivrée, cette molécule pourra être commercialisée auprès de millions de patients atteints de Sclérose en Plaques.
La démarche semble faisable mais il ne faut pas oublier que la sclérose en plaques est une maladie dont les mécanismes ne sont pas tous connus.
Après l'avis du Comité de Transparence (CT), le Comité Economique des Produits de Santé (CEPS) négociera avec l'industriel pour fixer le prix de commercialisation.
Le traitement avoisinera probablement 2000€*, prix moyen pour des médicaments destinés à traiter des maladies neurodégénératives.
Ce médicament sera potentiellement remboursé suivant l'ASMR
(Amélioration du Service Médical Rendu) décrétée par les instances d'évaluation (HAS, CT, CEPS, UNCAM).
*basé sur les prix du natalizumab (TYSABRI) et du fingolimod (GILENYA) utilisés dans les formes très actives de sclérose en plaques récurrente
https://www.has-sante.fr/jcms/p_3067012/fr/medicaments-utilises-dans-les-formes-tres-actives-de-sclerose-en-plaques-recurrente