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스크립트

Extracción y procesamiento downstream de proteínas recombinantes derivadas de plantas

Introducción

Ventajas de las plantas como plataformas de expresión

Desafío 1: liberación del producto

Automatizado

Diversidad en

estrategias

de

producción

DESAFÍOS

Bajo

costo de

infraestructura

Altamente

escalable

Sistemas de plantas

más escalables se basan en la expresión de proteínas intracelularmente

Retención por

presencia de

pared vegetal

Producto retenido

en compartimentos

intracelulares

Necesario

Técnicas que permitan procesamiento tisular:

  • Evitando la liberación significativa de contaminantes
  • Obtención un alto % de recuperación de la proteína de interés

Costos y competitividad del proceso

Desafío 2:

impurezas

Fibras, aceites, proteasas, polifenoles, ácidos orgánicos, metabolitos específicos

Upstream VS downstream

Bajo costo de producción upstream

Posibles modificaciones del producto y daños en equipo de procesamiento

Centrifugación, filtración y métodos integrados

DSP = 80% del costo total

  • altos rendimientos significan menos filtros y menos resina para cromatografías
  • adición de pasos de ultrafiltración o filtración

Conclusión

  • competencia con plataformas convencionales
  • combinación óptima de huésped, estrategia de expresión y un DSP eficiente
  • nuevas soluciones técnicas

Purificación del producto

Cromatografías

Ultrafiltración y Filtración

Hidrofóbica

Modo mixto

De exclusión molecular

Afinidad

Intercambio iónico

Intercambio aniónico

Intercambio catiónico

Beneficios

  • alto rendimiento volumétrico
  • fácil de escalar
  • se obtiene una alta concentración de extracto
  • bajo costo

Desventaja

poca disponibilidad de membranas con distintos tamaños, especialmente en el rango de 50-500 kDa.

Tamaño debe diferir: X2

Métodos integrados

Caracterizar el estado oligomérico de las proteínas contaminantes

  • Separación sólido-líquida
  • ATPS
  • EBA
  • proteínas de fusión

• Desarrollo del proceso downstream

  • extracción
  • separación sólido-líquida
  • purificación
  • concentración

Lectina

Fosfinotricina N-acetiltransferasa

  • semillas
  • 5 etapas
  • pureza >95%
  • recuperación 20%
  • semillas de algodón
  • 1 etapa
  • pureza >95%
  • recuperación 30%
  • varias rondas de clarificación del extracto

menos:

  • pasos
  • costos iniciales
  • modificación y degradación de la proteína de interés.

más

  • rápido

ejemplos

ATPS (separación acuosa en dos fases )

INTEGRA:

sólido-líquido

purificación

POLÍMERO

SAL

Proteína Hidrofóbica

PARÁMETROS

concentración de polímeros

pH del buffer

salinidad

Peso Molecular PEG

A

T

P

S

ADITIVOS

Peso Molecular Proteína

citrato

detergentes

Peso Molecular PEG

Proteínas de Fusión

HIDROFOBINAS

OLEOSINAS

ELPS

Extracción y clarificación

Bibliografía

Extracción a partir de biomasa

Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. J.F. Buyel, R.M Twyman, R.Fischer. 2015

Remoción de contaminantes

Ventajas

Mediante el

uso de:

Fácilmente escalable

PRECIPITACIÓN

Operación en continuo

Buffers: antioxidantes + agentes reductores + agentes quelantes + detergentes + agentes caotrópicos

Sales (ppio de disminución de solubilidad)

pH (ppio de disminución de solubilidad y desnaturalización selectiva)

T (ppio de desnaturalización selectiva)

Equipos sencillos

Agentes precipitantes

de bajo costo

Isolation and purification of proteins. Edited by: Rajni Hatti-Kaul and Bo Mattiasson. Marcel Dekker. 2003. ISBN 0-8247-0726-5

Filtración

Centrifugación

Baratos

Grandes volúmenes

Retención de contaminantes

Equipos fiables

Proceso continuo

Flexible

Contaminación cruzada

escalado

Rito-Palomares, M. (2004). Practical application of aqueous two-phase partition to process development for the recovery of biological products. In Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences (Vol. 807, pp. 3–11)

Homogeinización del tejido

  • Pasos de molienda en seco o húmeda + homogeinizadores basados en cuchillas o prensas

  • Métodos alternativos: lisis enzimática, sonicación y congelación/descongelación

Optimización de las estrategias de clarificación

Escalado difícil

FLOCULACIÓN

seguros

biodegradables

bajo costo

pH

conductividad

tipo de polímero

concentración: 0,5-5,0 g/L

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