Extracción y procesamiento downstream de proteínas recombinantes derivadas de plantas
Introducción
Ventajas de las plantas como plataformas de expresión
Desafío 1: liberación del producto
Diversidad en
estrategias
de
producción
DESAFÍOS
Bajo
costo de
infraestructura
Sistemas de plantas
más escalables se basan en la expresión de proteínas intracelularmente
Retención por
presencia de
pared vegetal
Producto retenido
en compartimentos
intracelulares
Necesario
Técnicas que permitan procesamiento tisular:
- Evitando la liberación significativa de contaminantes
- Obtención un alto % de recuperación de la proteína de interés
Costos y competitividad del proceso
Desafío 2:
impurezas
Fibras, aceites, proteasas, polifenoles, ácidos orgánicos, metabolitos específicos
Bajo costo de producción upstream
Posibles modificaciones del producto y daños en equipo de procesamiento
Centrifugación, filtración y métodos integrados
DSP = 80% del costo total
- altos rendimientos significan menos filtros y menos resina para cromatografías
- adición de pasos de ultrafiltración o filtración
Conclusión
- competencia con plataformas convencionales
- combinación óptima de huésped, estrategia de expresión y un DSP eficiente
- nuevas soluciones técnicas
Purificación del producto
Cromatografías
Ultrafiltración y Filtración
Hidrofóbica
Modo mixto
De exclusión molecular
Afinidad
Intercambio iónico
Intercambio aniónico
Intercambio catiónico
- alto rendimiento volumétrico
- fácil de escalar
- se obtiene una alta concentración de extracto
- bajo costo
poca disponibilidad de membranas con distintos tamaños, especialmente en el rango de 50-500 kDa.
Métodos integrados
Caracterizar el estado oligomérico de las proteínas contaminantes
- Separación sólido-líquida
- ATPS
- EBA
- proteínas de fusión
• Desarrollo del proceso downstream
- extracción
- separación sólido-líquida
- purificación
- concentración
Lectina
Fosfinotricina N-acetiltransferasa
- semillas
- 5 etapas
- pureza >95%
- recuperación 20%
- semillas de algodón
- 1 etapa
- pureza >95%
- recuperación 30%
- varias rondas de clarificación del extracto
menos:
- pasos
- costos iniciales
- modificación y degradación de la proteína de interés.
más
ATPS (separación acuosa en dos fases )
INTEGRA:
sólido-líquido
purificación
PARÁMETROS
concentración de polímeros
pH del buffer
salinidad
A
T
P
S
ADITIVOS
Proteínas de Fusión
HIDROFOBINAS
OLEOSINAS
ELPS
Extracción y clarificación
Bibliografía
Extracción a partir de biomasa
Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. J.F. Buyel, R.M Twyman, R.Fischer. 2015
Remoción de contaminantes
Ventajas
Mediante el
uso de:
Fácilmente escalable
PRECIPITACIÓN
Operación en continuo
Buffers: antioxidantes + agentes reductores + agentes quelantes + detergentes + agentes caotrópicos
Sales (ppio de disminución de solubilidad)
pH (ppio de disminución de solubilidad y desnaturalización selectiva)
T (ppio de desnaturalización selectiva)
Equipos sencillos
Agentes precipitantes
de bajo costo
Isolation and purification of proteins. Edited by: Rajni Hatti-Kaul and Bo Mattiasson. Marcel Dekker. 2003. ISBN 0-8247-0726-5
Filtración
Centrifugación
Baratos
Grandes volúmenes
Retención de contaminantes
Equipos fiables
Proceso continuo
Flexible
Contaminación cruzada
escalado
Rito-Palomares, M. (2004). Practical application of aqueous two-phase partition to process development for the recovery of biological products. In Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences (Vol. 807, pp. 3–11)
Homogeinización del tejido
- Pasos de molienda en seco o húmeda + homogeinizadores basados en cuchillas o prensas
- Métodos alternativos: lisis enzimática, sonicación y congelación/descongelación
Optimización de las estrategias de clarificación
FLOCULACIÓN
seguros
biodegradables
bajo costo
pH
conductividad
tipo de polímero
concentración: 0,5-5,0 g/L