TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Natalia O. Hernández

El ARN puede transferirse de un gel a un soporte sólido mediante un procedimiento relacionado llamado

Secuenciamiento

Northern Blotting

Enzimas de restricción

La hibridación de una sonda puede revelar el tamaño de una molécula de ARNm particular, su abundancia relativa, o los tejidos en los que se transcribe el mRNA

Tipo de enzimas

• Enzimas de restricción de tipo I y tipo III: Cortan ADN en sitios fuera de las secuencias de reconocimiento
• Enzimas de restricción de tipo II: Reconocen secuencias específicas y cortan el ADN dentro de la secuencia de reconocimiento

Prácticamente todo el trabajo de genética molecular se realiza con enzimas de restricción de tipo II

Tipos de corte

Un descubrimiento clave en el desarrollo de métodos genéticos moleculares fue el descubrimiento a finales de los años sesenta de las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción) que reconocen y hacen cortes de doble cadena en el ADN en secuencias de nucleótidos específicas.

Las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción son usualmente palindromicas

En la practica

Estas enzimas son producidas naturalmente por las bacterias, donde se utilizan en la defensa contra los virus.

Una bacteria protege su propio ADN de una enzima de restricción modificando la secuencia de reconocimiento, usualmente añadiendo grupos metilo a su ADN.

Aplicación

¿Que hacer cuando se necesitan varias copias de un fragmento de ADN?

Electroforesis

¿En cuántos fragmentos se cortó el ADN? ¿Cuáles son los tamaños de los fragmentos resultantes? ¿Cómo saber que una PCR funciono?

Electroforesis en gel de Poliacrilamida

• La poliacrilamida se forma por copolimerización de dos compuestos,
• La acrilamida
• la bis-acrilamida (N,N'-metilén-bis-acrilamida),
• la Tetrametiletiléndiamina (TEMED)
• el persulfato de amonio.

• La electroforesis es una técnica bioquímica estándar para separar moléculas sobre la base de su tamaño y carga eléctrica

• Para separar moléculas de ADN, se usa electroforesis en gel.

El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monómero de acrilamida para que polimerice.

Bromuro de Etidio o Silver green

Marcador de Peso

• Una forma de amplificar un fragmente específico de ADN es colocar el fragmento en una célula bacteriana y permitir que la célula reproduzca el ADN.

• Se trata de un compuesto intercalante, es decir, que tiene afinidad para unirse al DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas,

• Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia, exaltada al encontrarse en un entorno hidrófobo, es decir, al estar unido al DNA.

• En la electroforesis, se utiliza para "teñir" el DNA, para revelar su posición en el gel. Se puede bañar el gel tras la electroforesis en una disolución de bromuro de etidio, o bien incorporar éste a la disolución de agarosa con la que se prepara el gel,

Altamente Tóxico

Componentes de la electroforesis en gel de agarosa:

Equipo para la electroforesis

Agarosa

• Un gel poroso se hace a menudo de agarosa (un polisacárido aislado de algas marinas), que se funde en una solución tampón y se vierte en un molde de plástico.
• A medida que se enfría, la agarosa se solidifica, haciendo un gel que se ve algo así como gelatina rígida.

Buffer de corrida

Buffer de carga

• Solución tampón usada para diluir la agarosa y permitir la migración de las moleculas de ADN

• En la electroforesis, permite mantener las moléculas de DNA con una carga negativa uniforme y constante. Es por ello, componente del gel y del tampón de electroforesis, o tampón de cubeta.

• Se trata de un compuesto coloreado y con carga, utilizado para comprobar el progreso de la electroforesis.

• En la electroforesis, por su menor tamaño, se mueve más rápido que la mayoría de moléculas de DNA (siempre que éstas sean superiores a 300 pb), es decir, marca el "frente de avance". Puesto que su color azul-violeta es bien visible, permite detener la electroforesis con la confianza de que las moléculas de DNA no se hayan salido del gel.

• Adicionalmente, se prepara con glycerol para darle peso a la muestra y permitir que se vaya al fondo del pozo

Clonación de genes

La electroforesis en gel nos proporciona un medio para responder a estas preguntas

¿Cómo hacer clonación de genes?

A través de vectores de clonación

Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

Southern Blotting y Sondas

¿Cómo se localizan los fragmentos deseados en una gran reserva de ADN?

• Modificación de la PCR, usada para determinar cuantitativamente la cantidad de ácido nucleico
• La clave en la PCR cuantitativa es la posibilidad de detectar en tiempo real la amplificación de
• nuestro genoma de interés.

Componentes de la PCR en tiempo real

ADNc

Para obtener el ADNc es necesario realizar una PCR transcriptasa reversa

A menudo, la PCR en tiempo real se combina con PCR de transcripción inversa para medir la cantidad de ARNm en una muestra, lo que permite a los biólogos determinar el nivel de expresión génica en diferentes células y bajo diferentes condiciones.

• ADNc
• dNTPs
• Primers
• Kit

SYBR Green

• Un enfoque consiste en utilizar una sonda, que es una molécula de ADN o ARN con una secuencia de bases complementaria a una secuencia en el gen de interés.

• Las bases de una sonda se emparejarán sólo con las bases en una secuencia complementaria y, si se marca adecuadamente, la sonda puede usarse para localizar un gen específico u otra secuencia de ADN.

• Molécula cargada positivamente que en solución sin unirse al ADN de doble cadena no emite fluorescencia;

• Se une al surco menor del ADN y produce fluorescencia

Reacción en cadena de la polimerasa

Western blotting

¿Como facilitar la servida de las muestras?

¿Donde coloco la muestras?

ADN

Extensión- Polimerización

¿Que equipo usar?

• Es necesario identificar el gen que se desea amplificar,
• Hacer una extracción de ADN de la especie que vamos a trabajar

¿Como hago una PCR?

¿Como diseñar los primers?

• Es la transferencia de proteínas de un gel a una membrana.
• Aquí, la sonda suele ser un anticuerpo, utilizado para determinar el tamaño de una proteína en particular y el patrón de expresión de la proteína.

Necesito hacer un mix de los anteriores componentes

BIOINFORMATICA

MANUAL

Cloreto de magnesio

Tampão

Taq ADN

dNTPs

Primers

ADN

PCR ha sido la invención más importante de la década pasada que ha revolucionado el campo de la biología molecular. Comenzando con una única copia de ADN, la PCR puede generar miles de millones de copias de ese ADN en pocas horas,

Características de los oligonucleotidos

¿Como hacer para amplificar solo el gen a estudiar del total del ADN?

Plásmidos

¿Como funciona la PCR?

• Temperatura de Melting
• Cantidad de G-C
• Longitud del primer
• Posibilidad de formas dimeros
• Dos oligonucleotidos necesarios (Forward y Reverse)

A través de ciclos de temperaturas

Desnaturación 90°-95°

Apareamiento de los primers 45°-65 °

Extensión 72° (dependiendo del tipo de Taq)

1 nanograma (ng) de ADN puede amplificarse para obtener mg de ADN utilizando esta técnica.

La técnica de PCR se basa en la amplificación enzimática in vitro de una secuencia de ADN diana específica en un proceso cíclico usando dos oligonucleótidos.

¿Que son los oligonucleotidos?

dNTPs: Dinucleotidos trifosfato

También conocidos como primers o cebadores, son los encargados de iniciar la amplificación del gen

Son los nucleotidos que usa la ADN polimerasa para sintetizar la molécula

Desnaturación

¿Recuerdan los primers en la replicación?

Tienen la misma función!!!

ADN polimerasa

• Es la enzima encargada de realizar la síntesis de la hebra complementaria a partir de la hebra molde

¿Recuerdan la ADN polimerasa en la replicación?

Apareamiento de los primers

COMPONENTES DE LA PCR

Íons

Tienen la misma función!!!

• Ayudan a la ADN polimerasa a catalizar la reacción,
• Están incluídos en el kit de la ADN polimerasa

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/

¿Como saber si una amplificación funciono?

Mutaciones Oligonucleotido dirigidas

Marcadores moleculares

Marcadores Moleculares

Mutagenesis

Sitio dirigida

Mutagenesis

Aleatoria